基于QTL和转录组共定位筛选海岛棉纤维强度候选基因

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棉花(Gossypium spp.)是我国重要的农业经济作物之一,棉纤维是纺织工业重要的原材料。随着纺织业技术的不断更新,对棉纤维品质的要求也逐步提高。海岛棉(Gossypium barbadense.)具有优异的纤维品质,其中以纤维长度和纤维强度最为突出。然而海岛棉的生长环境受到地域限制,利用传统的育种方法选育新品种,周期长,效率低。分子生物学的飞速发展为此提供了有效的解决途径。利用多组学联合分析的方法,发掘与纤维强度有关的功能基因,从分子层面提高了基因的利用率,打破了生长环境带来的局限性,对棉花纤维品质的改良具有重要的意义。本研究利用SLAF-seq技术对海岛棉RIL群体进行SNP标记的发掘,构建了海岛棉种内连锁遗传图谱,在鉴定多年群体纤维品质性状的基础上,进行全基因组QTL检测;同时,对RIL群体双亲不同纤维发育时间点的纤维组织进行转录组测序。经过QTL和转录组共定位筛选候选基因。主要结果如下:(1)本研究利用SLAF-Seq技术对RIL群体(Pima S-7×5917)进行标记的发掘,成功构建了含有7171个SNP标记的海岛棉种内连锁遗传图谱,总遗传距离为2627.20c M,标记间平均遗传距离为0.37c M。以海岛棉标准系Pima3-79作为参考基因组。结合5年纤维强度性状的表型数据,鉴定出16个QTL位点,分布在8条染色体上。(2)采集RIL群体亲本Pima S-7和5917纤维发育第0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA、30DPA和35DPA的纤维组织进行转录组测序,每份样本3个生物学重复。对转录组数据中的差异表达基因进行分析。在2个亲本Pima S-7和5917纤维发育的8个时间点,分别鉴定出583/634、805/1502、1099/756、2760/1548、2305/842、1426/2101、2311/1435和2903/4504个基因上调或下调表达。用短时间序列分析软件(Short Time-series Expression Miner,STEM)进行基因表达模式的鉴定,从Pima S-7和5917中分别鉴定出9个和7个profile,其中profile7和profile8是两者共同富集的主要表达模式。利用加权基因共表达网络分析法(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)检测出8个与纤维发育时间点相关的模块,其中3个模块被鉴定为与纤维次生壁加厚期紧密相关的特异性模块。以KME>0.85为标准,筛选出1275个基因作为核心基因。通过GO和KEGG富集分析,特异性模块内的基因大部分富集到细胞壁合成及微管相关的途径。(3)对QTL置信区间内的基因和转录组分析获得的1275个基因进行比较,得到47个基因不仅位于QTL置信区间内,又在与纤维次生壁发育期显著相关的特异性模块中。利用GO和KEGG对47个基因进行富集分析。47个基因在三大注释分类中,均富集在细胞骨架和细胞骨架组成成分之一的微管及微丝相关通路上。因此,以5个微管和微丝相关的基因作为进一步研究的候选基因。(4)在RIL群体亲本Pima S-7和5917的第0-35DPA纤维组织和海岛棉资源中纤维强度具有显著差异的10个极端材料的第0-30DPA的纤维组织中,利用q RT-PCR方法,对5个候选基因进行表达量的测定。结果表明,5个基因在亲本和极端材料中表达量的上调或者下调趋势是相同或相似的,该趋势与5个基因在转录组中不同纤维发育时间点的上调或者下调趋势也相同。对5个候选基因进行克隆,并利用VIGS(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术分别沉默其中WDL2和TUBB5。通过q RT-PCR技术检测到沉默2个候选基因后,棉花纤维素合成酶及苯丙烷通路的相关基因表达受到抑制,初步推测WDL2和TUBB5基因可能通过调节纤维合成酶的转运及苯丙烷代谢通路的关键基因的表达对纤维强度的形成进行调控。
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