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第一部分皮下注射氢溴酸东莨菪碱建立兔干眼模型的实验研究目的:探讨兔皮下注射氢溴酸东莨菪碱,建立干眼模型的特点和眼表病理损害机制。方法:健康新西兰大白兔18只,随机分为三组,每组6只。实验组皮下注射氢溴酸东莨菪碱,其中低剂量组(L,1.0mg/次)、高剂量组(H, 2.0mg/次),对照组注射等量生理盐水。注射时间点为每天8点11点、14点和18点,连续30天。用药后0、7,14,21,30d对实验组及对照组行泪液分泌试验、泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素染色,印迹细胞检查。第30d空气栓塞法处死实验动物,取角膜、结膜及泪腺组织行HE染色,免疫组化检测FAS,BCL-2及NFκB)的表达水平。结果:酚红棉线法测得高剂量(H)组造模前泪液分泌量为16.25±2.299mm,第21d时下降为6.75±1.982mm,对照组为16.50±2.619mm,差异具有统计学意义(p<0.05),同期低剂量组(L)为15.00±2.390mm,与对照组相比无明显差异。H组第3d出现BUT缩短,L组则第7d发生BUT的变化,此后BUT值均低于5s,对照组BUT大于20s。实验组均出现角膜荧光素染色阳性,H组出现时间早(3d),持续时间长。L组和H组PAS染色与对照组相比,杯状细胞形态紊乱、核淡染,部分核固缩,L组和H组之间无明显差异。HE染色显示H组泪腺周围见散在淋巴细胞和腺腔凋亡性改变,角膜上皮呈重度瘤样增生基质层变性伴水肿,结膜杯状细胞反应性增多,固有层见淋巴细胞浸润数量增加。L组角膜浅层上皮轻度增生,细胞排列稍紊乱,结膜和泪腺组织病理改变轻微。电镜观察高剂量组泪腺腺管管腔壁绒毛较对照组明显减少,角膜表层微绒毛较对照组减少,上皮细胞空泡变,细胞核固缩,结膜表面微绒毛减少,上皮细胞呈坏死凋亡改变,低剂量未见明显显微改变。凋亡抑制因子BCL-2在高剂量模型组泪腺、角膜和结膜组织中极少表达,对照组各组织均呈高度阳性表达,两组差异显著p<0.001;促凋亡因子Fas在模型组泪腺组织中呈中度表达,在角膜和结膜组织中呈中高度表达。炎症转录因子NFκB在模型组兔眼泪腺腺泡细胞胞浆和胞核轻度表达,腺腔管壁细胞胞核和胞浆中重度表达,角膜组织上皮细胞和基底细胞胞浆、胞核以及结膜上皮细胞中NFκB呈中度阳性表达,对照组各组织NFκB极少表达,两组差异有统计学意义(p<0.001)。结论:兔皮下注射氢溴酸东莨菪碱,4次/天,2.0mg/次,可有效维持药物外周浓度,抑制泪腺的分泌,引起角结膜上皮细胞的损伤以及角结膜上皮和泪腺组织细胞凋亡因子和炎症因子阳性表达增加,成功建立以泪液缺乏为主,凋亡和炎症反应共同参与的干眼动物模型。第二部分FK506对氢溴酸东莨菪碱至兔干眼模型的疗效目的:观察FK506滴眼液干预兔干眼模型的疗效及其作用机制方法:健康新西兰大白兔30只,,随即分为实验组18只和对照组12只。实验组采用上述方法每天8点11点、14点和18点皮下注射氢溴酸东莨菪碱注射液2.0mg/次,并从第四天开始左眼点0.05%FK506滴眼液,4次/天,右眼不做处理,对照组皮下注射生理盐水。实验第0,3,7,14,21,35d对实验组及对照组行泪液分泌试验、泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素染色检查。分别在第7,14,和35d采取空气栓塞法分别随即处死模型组5只兔子,取双眼角膜、结膜和泪腺组织,PCR定量分析IL-1β、TNF-α和MMP-9等炎性因子在各组织的表达。第35d采用印记细胞学方法取双眼角结膜上皮细胞行免疫组化检测NFκB表达水平的差异。结果:造模后3,7天实验兔双侧眼均角膜荧光素染色强阳性。第14d开始FK506治疗眼角膜荧光素染色评分低于未用药眼,至第35d,差异进一步增大具有统计学意义(P<0.01)。FK506治疗组眼的角结膜上皮NFκB表达显著低于对照眼,不同时间点治疗组结膜组织中IL-1β、TNF-α和MMP-9表达水平低于对照组,两者差异有统计学意义(p<0.05)。14天时双侧泪腺MMP-9水平造模后与对照组相比呈现增高,但用药干预眼与未治疗眼之间无明显差异。结论:FK506通过抑制炎症信号分子NFκB的激活,降低角膜,结膜组织中IL-1β、TNF-α和MMP-9等炎症因子的水平,有效地抑制眼表免疫性炎症,进而减轻干眼对眼表组织的损害。