链霉菌微型转座系统的构建及初步应用

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随着天蓝色链霉菌A3(2)和阿维链霉菌MA-4680的全基因组序列的发表,链霉菌的基础研究已进入后基因组时代,大量新基因和功能未知基因的功能有待鉴定。大规模突变体库的构建是功能基因组研究的一个重要内容,而利用转座子进行插入突变构建突变体库则是目前广泛应用的方法之一。 转座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在链霉菌中应用的大多数转座子却普遍存在转座效率低下或操作繁琐等缺点。仅有Tn4556及其衍生物和Tn5衍生转座子能够被应用于突变体库的构建和突变菌株的筛选。但是它们依然存在各种缺陷。 针对现有转座子系统的一些缺陷,构建了应用于链霉菌中的携带微型转座子mini-Tn4560A的质粒载体pHL265。它携带的转座酶基因tnpA位于转座子mini-Tn4560A外部,转座发生后,质粒载体pHL265由于不具有链霉菌复制子而不能在宿主菌中存在,失去了转座酶基因的微型转座子理论上将不可能发生二次转座;带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,将有利于转座子载体通过接合转移的方式从大肠杆菌导入到链霉菌中,大大降低了原生质体转化过程中自体突变的可能;转座子直接进行体内转座,省去用Tn5体外转座时要构建基因组文库,再将体外转座突变体库重转入链霉菌,筛选突变菌株的复杂过程。 利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1000株转座突变株。其中不乏表型异常的菌株。选取其中的8株,经Southern杂交验证可知该转座子的转座基本具有随机性;通过连续的松弛传代培养可知该转座子在宿主DNA中稳定存在。此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了一个新的技术手段。
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