论文部分内容阅读
第一部分微囊藻毒素-RR持续暴露导致小鼠水代谢异常机制研究目的:探究微囊藻毒素-RR(MC-RR)连续染毒对小鼠水代谢的影响及主要作用机制。方法:第一阶段:将28只6～7周龄SPF级雄性昆明小鼠随机分为4组,连续腹腔注射 MC-RR(A:140μg/kg,B:70μg/kg,C:35μg/kg,D:0μg/kg)30 天,每天记录小鼠的体重、饮水量和尿量,30天后观察小鼠肝脏、肾脏的损伤情况,检测肝组织血管紧张素原(AGT)基因的表达水平。第二阶段:建立在第一阶段的实验基础上。将56只6～7周龄SPF级雄性昆明小鼠随机分为8组,每组7只。其中四组连续腹腔注射MC-RR(A:140μg/kg,B:70μg/kg,C:35μg/kg,D:0μg/kg)30 天后停止染毒,继续观察至42天,记录小鼠每天的饮水量、尿量和体重变化,42天后检测小鼠肝脏损伤情况以及体内RAS水平;另外四组小鼠连续腹腔注射染毒至60天,每天观察延长染毒期间各组小鼠的饮水量、尿量和体重的变化,60天后检测各染毒剂量组小鼠肝脏、肾脏的组织病理学变化、血清生化酶等指标。第:三阶段:将168只6～7周龄SPF级雄性昆明小鼠随机分为4组,剂量同上,染毒28天,停药后继续观察至42天,在此过程中将染毒第7、14、21、28、35和42天设置为取样时间点,每组每次取样量为n=7,检测每个时间点各个染毒剂量组小鼠的组织病理学变化、脏器系数、尿比重、尿电解质、尿微量白蛋白、血清生化酶、血清RAS水平、血清AVP浓度等指标。第四阶段:将28只6～7周龄SPF级雄性昆明小鼠随机分为4组,用肾素血管紧张素系统(RAS)阻断剂阿利吉仑(aliskiren)和MC-RR联合染毒验证由前三个实验阶段结果得出的实验结论,注射剂量分别为140μg/kg MC-RR、140μg/kg MC-RR+100 mg/kg阿利吉仑、140 μg/kg MC-RR+50 mg/kg阿利吉仑、生理盐水,连续腹腔注射30天,每天记录各剂量组小鼠的饮水量和尿量,第30天对小鼠体内RAS水平进行检测。结果:(1)140 μg/kg MC-RR剂量组在染毒第9天起饮水量和尿量增加,随着染毒时间的积累,与对照组饮水和尿量的差别逐渐加大,在染毒第30天时高剂量组尿量约为对照组的5倍,饮水量约为2倍;染毒停止后,140 μg/kg MC-RR剂量组小鼠尿量在一周内恢复到对照组水平;60天延长染毒实验中,140μg/kg组小鼠的饮水和尿量持续升高至30天,然后进入第一个平台期(尿量为0.21～0.25 ml/g/day,饮水量为0.51～0.60 ml/g/day),在染毒第43天时饮水和尿量再次升高,并进入第二个平台期(尿量为0.25～0.32ml/g/day,饮水量为 0.60～0.68ml/g/day),持续至染毒结束。(2)140μg/kg MC-RR剂量组小鼠体重增长明显低于对照组,肝脏损伤明显,主要表现为:与对照组比较,肝脏脏器系数值增大(P<0.05),组织病理学观察可见肝细胞肿胀,炎性细胞浸润,血清ALT、AST、ALP等酶学指标呈时间依赖性升高,然而在整个实验过程中未观察到明显的肾脏损伤:肾脏组织病理学观察未见异常,BUN、CREA、UA、尿微量白蛋白(mALB)、尿电解质等指标未见病理性异常变化。(3)140μg/kgMC-RR染毒组小鼠肝脏血管紧张素原(AGT)mRNA表达水平上调至对照组水平的1.5倍左右(P<0.05),同时血清RAS标志物浓度呈时间依赖性升高,并与肝脏损伤指标的变化趋势相一致。血清AVP检测值也增高。(4)停止染毒后,MC-RR引起的多饮、多尿、增高的RAS标志物水平和肝脏损伤在一至两周内陆续恢复到对照组水平;100 mg/kg剂量的RAS阻断剂(阿利吉仑)可几乎完全抑制140μg/kg MC-RR引起的多饮,多尿以及体内增高的RAS标志物水平,在不同阻断剂量下呈现典型剂量效应关系。结论:在非致死较高剂量持续暴露下,MC-RR可以通过肝脏损伤引起昆明小鼠体内RAS级联水平升高,最终导致多饮、多尿等水代谢异常。第二部分微囊藻毒素-RR对小鼠神经行为的影响及机制初探目的:实验观察微囊藻毒素-RR(MC-RR)重复染毒对小鼠神经行为的影响,并初步探究可能的作用机制。方法:28只6～7周龄SPF级雄性昆明小鼠随机分为4组,连续腹腔注射染毒MC-RR(A:140μg/kg,B:70μg/kg,C:35 μg/kg,D:0 μg/kg)7天,染毒3天开始水迷宫实验训练,第7天进行水迷宫实验和旷场实验。染毒结束后透射电镜观察实验小鼠大脑皮层血脑屏障超微结构的改变,免疫组化和液质方法检测染毒小鼠脑组织中MC-RR的积累,高效液相荧光方法检测脑组织中四种氨基酸类神经递质的含量,荧光定量法比较Oatp家族在小鼠脑组织和肝脏中基因的mRNA表达种类和表达量的差异。结果:140μg/kg MC-RR染毒7天可致昆明雄鼠自发活动增强,但未观察到对小鼠学习记忆的影响;140 μg/kg MC-RR剂量组小鼠大脑皮层毛细血管内皮细胞超微结构改变,表现出胞内内质网扩张,线粒体肿胀;免疫组化分析结果可见小鼠大脑皮层细胞中MC-RR的积累量随着染毒剂量的提高逐渐增多,MMPB氧化还原-液质检测法在各剂量组均未检测到MC-RR;高剂量MC-RR可引起脑组织中四种氨基酸类神经递质含量升高:谷氨酸,天冬氨酸,甘氨酸,γ-氨基丁酸,分别达到7.79 ±2.40 mg/kg,4.30± 0.67 mg/kg,2.30 ±0.67 mg/kg,1.30 ±0.19 mg/kg,且与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而另外两个剂量组与对照组比,脑组织中四种氨基酸的含量虽有增高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);荧光定量PCR方法检测到小鼠脑组织中Oatp1c1、Oatp3a1、Oatp1a4 基因的 mRNA 表达水平较高,Oatp1a1、Oatp1b2、Oatp2b1、Oatp2a1、Oatp1a5这些在肝组织中mRNA表达水平较高的Oatps在脑组织中也有不同程度的表达。结论:MC-RR可能通过Oatps转运到小鼠大脑皮层,引起线粒体内质网结构的破坏,神经递质的异常释放,最终导致小鼠自发活动增强的行为学改变。