论文部分内容阅读
目的:(1)探索通过将骨髓间充质干细胞诱导所得内皮样细胞与骨髓间充质干细胞制备的细胞片混合培养,初步探讨两者共同培养体外血管形成的可行性。(2)同时并将混合培养后的细胞片运用于完全游离的缺血皮瓣模型,评估体内血管形成的潜能。方法:(1)骨髓间充质细胞(BMSCs)提取、培养及流式鉴定:取SPF级4周龄雄性SD大鼠,处死后提取骨髓冲洗液,采用全骨髓差异贴壁培养法,体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),取培养所得P4代BMSC,胰酶消化后运用流式细胞计数检测表面标记物CD90、CD73、CD11b、CD45、CD31。(2)抗坏血酸介导BMSC形成细胞片:取培养所得P4代BMSC,加入含有抗坏血酸的培养基中培养10天后形成可通过细胞刮刮取的片状结构,分别加入成骨、成脂诱导培养基进行分化功能鉴定,并通过CCK8法检测、绘制加入与不加入抗坏血酸后的BMSCs生长曲线;行HE、Masson染色观察细胞片组织学结构。(3)BMSC向内皮样细胞诱导及鉴定:采用含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)合诱导因子方法将骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞,观察细胞形态变化及生长情况,免疫荧光检测细胞标志物CD31、Flt-1;流式细胞仪鉴定表面标记的表达,种植于Matrigel基质胶后的形态学变化。(4)荧光标记的BMSCs细胞膜片与内皮样细胞的体外体内混合培养:利用红色荧光蛋白(RFP)标记的BMSCs并诱导为内皮样细胞,与绿色荧光蛋白(GFP)标记的BMSCs细胞片混合培养后与荧光显微镜下观察细胞形态变化及迁移。并将混合培养后的细胞用于动物模型,术后两周处死、收集组织标本,行切片HE染色组织学观察及免疫荧光观察CD31阳性细胞分布。结果:(1)骨髓间充质细胞(BMSCs)提取、培养及流式鉴定:原代BMSC呈长梭形,呈集落漩涡状生长,经流式细胞术检测细胞结果示CD73、CD90阳性,CD11b、CD45、CD31阴性。(2)经加入抗坏血酸培养基培养的BMSCs较未加入的对照组细胞增殖加快,I型胶原纤维表达强于对照组,培养10天后可与培养皿内形成片状,经HE及Masoon组织学切片显示加入抗坏血酸组较对照组细胞间大量胶原沉积,细胞重叠。经成骨及成脂诱导后的细胞片经成骨、成脂诱导后,油红O、茜素红染色呈阳性。(3)BMSC经内皮诱导后,倒置显微镜下观察可见其形态由长梭形渐成为短梭形,细胞密集处呈铺路石样结构,诱导后2周经流式细胞术鉴定显示CD31阳性率达91%。胰酶消化内皮样细胞后种植于Matrigel后4小时可观察到内皮样细胞小足伸出,呈网格状结构,8小时后渐聚集形成多个集落。RFP标记的内皮细胞与GFP标记的BMSCs细胞膜片混合培养后与荧光显微镜下观察,4小时后可见内皮细胞伪足伸出,呈长梭形,并相互连接呈网状,生长状态良好。(4)混合培养后的细胞片用于SD大鼠缺血皮瓣模型体内后,可形成毛细血管,与对照组相比较,毛细血管数量明显增多。结论:(1)经抗坏血酸诱导形成的BMSCs细胞膜片能够为BMSCs诱导分化所得的内皮样细胞生长及血管网络形成提供物理结构支撑,并能在体外及动物缺血皮瓣模型中共同形成具有功能的微血管样结构。(2)BMSCs构建的细胞膜片搭载内皮样细胞具有改善皮瓣及组织缺血、重建微血管的潜在作用。