定向固定化的蛋白具有均一的取向,能最大限度地保持蛋白的活性,因此蛋白的定向固定化在工业生物催化、临床诊断和蛋白相互作用分析等领域有着广泛的应用。近年来逐渐开发一些新的定向固定化方法。生物正交反应(如点击化学)需要引入非天然氨基酸,内含肽切割引入巯基则需要额外分离步骤等、存在产量低等问题,通过酶催化修饰特定的基序/标签,则需要消耗过量酶,且效率低。因此,目前的定向固定化方法都不适合大规模应用。本文利用Spy Catcher-Spy Tag反应特异性地、高效地形成异肽键的原理,以开发一种适用于工业酶的定向固定化,特别是从发酵细胞裂解液中目标蛋白直接定向固定化的新方法。此方法首先将Spy Catcher共价地固定在载体上,然后将Spy Tag融合的目标蛋白通过与Spy Catcher的连接反应,实现目标蛋白的定向固定化。本文选择广泛使用的商业化环氧载体LX-1000EP,并以红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)、戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶(Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase,GA)和甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH)为模式蛋白,建立并验证了基于Spy化学反应的蛋白定向固定化方法。Spy Catcher在p H 7.0,25℃下,与环氧载体LX-1000EP反应12小时,其固定化效率达到89.5±2.0%。融合蛋白Spy Tag-RFP/GA/FDH与Spy Catcher修饰载体在p H 7.0,25℃下孵育2小时,纯化的Spy Tag-RFP/GA的固定化效率和回收率在50-90%之间,蛋白活力回收率为环氧固定化法的2-3倍。本文进一步利用建立的新型固定化方法,从含有目标蛋白(Spy Tag-RFP/GA/FDH)的细胞裂解液中直接定向固定化目标蛋白,其固定化效率达到86%以上,活力回收率为30-90%,为常规环氧固定法的2-25倍。本论文基于Spy化学反应建立的蛋白定向固定化方法仅需首先固定Spy Catcher,不需要额外的化学试剂,且可以在温和的条件下快速、高效地实现蛋白固定化。由于Spy Catcher可以通过标准的发酵过程生产,使得这种固定化方法在工业规模上也是可行的,它可以直接从发酵液或细胞裂解液中固定化目标蛋白,具有很高的选择性和活性回收率。本方法可以简化蛋白的大规模定向固定化过程,为催化与分析领域中高性能固定化蛋白质的制备提供了前期实验基础。