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足细胞损伤是肾脏疾病发生发展的中心环节,足细胞是肾小球脏层上皮细胞,附于肾小球基底膜表面,是肾小球滤过屏障的重要组成,它功能多样、结构复杂,是一种终末分化细胞。足细胞在维护肾小球滤过屏障完整性、蛋白尿形成和肾小球硬化中具有重要作用。有研究表明,感染、免疫、代谢及环境毒素均能导致足细胞损伤,引发肾脏疾病。microRNA（miRNA）是一类小的（～21 个核苷酸）非编码RAN,可以在转录后水平抑制或者降解目标RNA。近年来,miRNA在足细胞损伤中的作用备受关注。足细胞特异性Dicer酶敲除小鼠模型表现为显著的足细胞损伤、蛋白尿和肾小球硬化。通过系统生物学分析,我们推测Dicer酶敲除小鼠肾脏表型可能与足细胞miRNA-30家族（miR-30s）丢失密切相关。以此为切入点,我们深入研究miR-30s参与足细胞保护的机制,并有望从一个全新的角度诠释足细胞损伤保护新机制。研究一:miR-30s与足细胞损伤研究目的:分析体内外足细胞在损伤因子刺激后miR-30s表达的改变,探索miR-30s表达下降是否参与了足细胞损伤。方法:收取临床及病理诊断明确的FSGS患者肾组织标本,以肾脏透明细胞癌患者癌旁正常肾组织为对照,显微镜下微分离肾小球行RT-PCR明确miR-30s在FSGS患者肾小球中的表达。采用原位杂交方法检测miR-30s在正常人及FSGS患者肾小球中的分布。利用慢病毒转染构建miR-30a高表达的人足细胞系。通过TGF-β/LPS/PAN刺激实验组和对照组细胞,采用tunel法、Annexin v法观察miR-30s在足细胞中的抗凋亡作用。通过F-actin染色验证miR-30s对足细胞骨架的保护作用。采用RT-PCR检测Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1、Trp53、Cdkn1a、Bax、Apaf1等蛋白的mRNA水平,采用western blotting检测及免疫组化检测ICN1、Notch1、Caspase3、P53蛋白的表达。构建PAN大鼠足细胞损伤模型,通过体内实验观察miR-30s对足细胞的保护作用。结果:我们研究发现,miR-30s在肾小球中特异性的表达于足细胞,原位杂交及荧光定量PCR结果提示FSGS患者肾小球中miR-30s成员表达显著下降。体外试验进一步发现一些常见的足细胞损伤因素如TGF-β/LPS/PAN均可下调足细胞miR-30s表达。经miR-30a质粒转染的足细胞可以有效抵御刺激因子所引起的足细胞损伤,如足细胞骨架紊乱/消失、足细胞凋亡等。相反,我们通过转染miRNA30-“sponge”质粒敲除足细胞miR-30s后,可以观察到明显的足细胞损伤,同时,它们对损伤因素刺激也更加敏感。这些实验说明miR-30s在足细胞中起着明显的保护作用,同时我们还发现,糖皮质激素可以维持足细胞miR-30s水平,抑制TGF-β等诱导的足细胞损伤。此外,我们进一步研究发现,Notch1在足细胞中为miR-30s的靶基因。miR-30s可以抑制Notch1受体表达阻断Notch1信号通路活化从而抑制足细胞凋亡。体外试验证实,足细胞经过TGFβ刺激后,Notch1信号通路显著激活,而转染miR-30a质粒的足细胞在TGF β刺激后Notch1信号通路活化得到明显的抑制。最后,我们体内实验发现嘌呤霉素（PAN）大鼠肾小球足细胞中miR-30s表达显著下降,糖皮质激素治疗后,大鼠肾小球中足细胞miR-30s部分恢复,并且可以显著减缓PAN大鼠肾脏损伤。结论:miR-30s在肾小球中特异性表达于足细胞且含量丰富,在损伤因素刺激下,足细胞中miR-30s表达下降,通过活化Notch1通路介导足细胞损伤。糖皮质激素可以维持miR-30s表达从而起到足细胞保护作用。研究二:miRNA-30家族调控足细胞Calcium-Calcineurin信号通路目的:Calcium-calcineurin信号异常激活可以导致足细胞损伤,但是其机制目前仍未十分明确。calcium-calcineurin通路中的多种相关分子都被预测为miR-30s的靶基因。miR-30s 在足细胞中表达下降可以导致足细胞骨架损伤的发生,但其具体的机制不明确。本研究的目的是探索miR-30s是否可以抑制足细胞cal cium-calcineurin信号通路从而起到足细胞保护的作用。方法:本研究通过构建足细胞特异性miR-30 Sponge转基因小鼠,嘌呤霉素核苷酸（PAN）大鼠进行体内实验,利用小鼠永生足细胞系进行体外试验,利用FSGS患者肾组织进行免疫组化等试验。结果:我们研究发现calcium-calcineurin信号通路相关分子TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及NFATC3在足细胞中含有高丰度的mRNA水平,但是其蛋白水平极低。TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1 及 NFATC3 蛋白在 FSGS 患者足细胞中表达显著上升,但mRNA含量保持不变。通过荧光素酶报告试验,我们进一步发现这些基因都是miR-30s的靶基因。体外试验证实,miR-30s可以抑制足细胞TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及NFATC3蛋白表达,同时可以抑制足细胞钙内流、calcineurin活性以及NFATC3的核转移。体内实验我们发现,与对照小鼠相比,足细胞特异性miR-30 Sponge转基因小鼠可自发出现蛋白尿,足突融合,同时,TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及 NFATC3 蛋白表达显著上调。此外,我们还发现PAN大鼠模型足细胞TRPC6、PPP3 CA、PPP3 CB、PPP3R1及NFATC3蛋白表达上升,而糖皮质激素腹腔注射或者miR-30a质粒尾静脉注射可以减少上述蛋白的表达并减轻PAN大鼠肾脏损伤的症状。结论:miR-30s 通过抑制 TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1 及 NFATC3蛋白表达紧密控制足细胞calcium-calcineurin信号通路活性。足细胞miR-30s表达下调将导致calcium-calcineurin信号通路异常活化并诱导足细胞损伤。