工作目的:探索转化生长因子β1（TGFβ1）及其信号通路在人膀胱癌细胞中的作用,研究重点是膀胱癌细胞的上皮间质转化（EMT）、迁移侵袭和干性能力的改变。在作用机制方面,主要探索长链非编码RNAs（lncRNAs）在TGFβ1信号通路中起到的调节作用,为膀胱癌的诊断和治疗提供新的靶点。研究方法:用5nM重组人TGFβ1和/或20nM TGFβ信号通路抑制剂SB-431542处理三株膀胱癌细胞,5637、T24和J82,显微镜下观察细胞形态变化。用蛋白质印迹和实时定量PCR检测细胞EMT改变,用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,用蛋白质印迹、流式ALDH1试剂盒、流式抗体CD44、成球实验检测细胞干性能力。用PCR矩阵数据筛选出能被TGFβ信号通路调控,又与EMT、干性表型相关的lncRNAs。用荧光素酶双报告基因检测TGFβ信号通路与lncRNAs的相互关系。用RNA干扰和质粒过表达的方法敲降和高表达lncRNAs,同时检测相应的表型和基因变化。在膀胱正常组织和癌组织样品中用实时定量PCR和蛋白质印迹的方法检测相关基因和蛋白的表达,并检测它们之间的相关性。结果:TGFβ1能在5637、T24、J82三株膀胱癌细胞中通过磷酸化SMAD2激活TGFβ信号通路。TGFβ1能引起膀胱癌细胞形态上发生EMT改变,并下调E-cadherin、上调 Vimentin 和 Fibronectin。EMT 相关的转录因子 SNAI1、SNAI2、ZEB1、ZEB2、TWIST1也同时被上调。TGFβ1还能促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。有趣的是,lncRNA ZEB2NAT调节了 TGFβ1引起的细胞学改变。当敲降ZEB2NAT时,会引起ZEB2蛋白的表达下降,并阻碍TGFβ1所引起的EMT和迁移侵袭。在临床样品中,与正常膀胱组织相比,TGFβ1、ZEB2NAT的mRNA表达,ZEB2的蛋白表达水平在膀胱癌组织中都是上调的。通过相关性分析,它们三者之间两两互为正相关。在细胞干性的研究中,TGFβ1还能增强膀胱癌细胞的干性能力。同时找到一个能被TGFβ1下调的lncRNA-LET。荧光素酶双报告基因结果显示,在lncRNA-LET的启动子区域有SMAD4的结合位点,这种结合能引起lncRNA-LET的转录抑制。研究同时发现,敲降lncRNA-LET能增强膀胱癌细胞的干性能力,并上调ALDH1A1、CD44、HMGA2、KLF4的蛋白水平。而高表达lncRNA-LET则会有相反的效果。LncRNA-LET能降低NF90的蛋白稳定性。LncRNA-LET所引起的细胞干性改变受NF90蛋白的调节。结论:TGFβ1在膀胱癌的进程中起了非常重要的作用。它能通过lncRNA ZEB2NAT促进膀胱癌细胞的EMT和迁移侵袭。它还能通过lncRNA-LET促进膀胱癌细胞的干性维持。TGFβ1在膀胱癌细胞中的调节通路有可能为临床治疗膀胱癌提供新的靶点。