恶性肿瘤是人类第二大“疾病杀手”,仅次于心脑血管疾病,是45-64岁人群的主要死因。其中口腔鳞癌是世界第八大恶性肿瘤,在中国的发病率显著高于西方发达国家。尽管手术、放疗、化疗和生物治疗等治疗手段不断进步,口腔鳞癌患者的五年生存率一直徘徊在50%-60%左右。为了提高口腔鳞癌患者的生存率,急需进一步揭示口腔鳞癌发生发展的机制。近年来越来越多的研究表明,肿瘤的发生发展依赖于肿瘤和肿瘤微环境的相互作用。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast,CAF）是肿瘤微环境中的重要细胞成分。CAF在口腔鳞癌的发生发展中起重要作用,但正常成纤维细胞（normal fibroblast,NF）如何异常活化为CAF机制未明。为了揭示NF恶性表型转化的关键分子,本课题从口腔鳞癌患者的正常粘膜组织及肿瘤组织中提取配对的NF及CAF,通过高通量测序及生物信息学分析,发现表皮调节素（Epiregulin,EREG）是NF和CAF中差异最显著的基因,并在另外5对配对的NF-CAF中通过qPCR、WB等方法进行验证,明确了 EREG在CAF中的基因表达及蛋白表达水平均显著高于NF。进一步,为探讨EREG在CAF中的高表达是否影响口腔鳞癌患者的预后,本课题对104例口腔鳞癌患者进行回顾性分析,结果表明,EREG在口腔鳞癌CAF中的高表达与较差的总体生存（p=0.0398）、较高的抓一律（p=0.0359）及较差的无病生存（p=0.0314）相关,是较差的总体生存（p=0.049,Exp（B）=2.758,95%CI:1.007-7.566）及较差的无疾病生存（p=0.04,Exp（B）=2.842,95%CI:1.048-7.71）的独立预后因素。此外,EREG在口腔鳞癌CAF中的高表达还与口腔鳞癌较晚的TNM分期（χ2=8.248,p=0.0041）、较大的浸润深度（χ2=22.29,p<0.0001）及较差的WPOI（χ2=20.97,p<0.0001）密切相关,提示高表达EREG的CAF可能通过促进口腔鳞癌的侵袭、转移,从而导致了 口腔鳞癌患者较差的预后。基于以上结果,我们初步推测EREG在成纤维细胞的的高表达促进了 NF的恶性表型转化,进而影响了口腔鳞癌患者的预后。为了证明此猜想,我们成功构建了 EREG过表达质粒及EREG干扰siRNA。结果发现,在NF中过表达EREG后,其SMA、Vimentin、N-cadherin等CAF标志物的表达显著升高（p<0.05）,且细胞活力增强（p<0.05）。在 CAF 中干扰 EREG 后,其 SMA、Vimentin、N-cadherin等CAF标志物的表达显著降低（p<0.05）,且细胞活力减弱（p<0.05）。此外,我们揭示了在NF中过表达EREG后,其JAK2-STAT3通路明显活化,且抑制JAK2-STAT3通路后,抑制了 EREG介导的NF恶性表型转化,说明EREG介导的NF-CAF表型活化是依赖于JAK2-STAT3通路的。另外,一般认为CAF是NF不可逆恶性活化的表型,而在CAF中干扰EREG后能“逆转”CAF的恶性表型,进一步说明EREG在NF-CAF的表型转化中起关键作用。除了 CAF标志蛋白表达上调、细胞活性提高等自身活化表型外,CAF区别于NF的另一重要特征是CAF促肿瘤的功能性表型。由于远处转移是口腔鳞癌患者的最重要死因,而侵袭是发生远处转移的前提条件,因此CAF促口腔鳞癌侵袭的作用尤其值得关注。本研究通过临床病例回顾性分析已经发现高表达EREG的CAF与口腔鳞癌较强的侵袭性、较高的远处转移率相关。在体外细胞实验中,我们进一步通过划痕实验和Transwell迁移和侵袭实验,揭示了 EREG的高表达能提升成纤维细胞促进肿瘤迁移和侵袭的能力。此外,我们更建立易操作、可重复的三维模型,直观地模拟了口腔鳞癌的体内侵袭过程,揭示了 CAF相比于NF具有显著的促口腔鳞癌侵袭能力,表现为肿瘤细胞间粘附降低（更差的浸润方式）及浸润深度加深等。此模型同时表明,在CAF中干扰EREG后其促肿瘤侵袭能力显著下降,而在NF中过表达EREG后,其促肿瘤能力显著增加,表现为更深的浸润深度和更差的浸润方式。为进一步揭示CAF中EREG促口腔鳞癌的机制,本研究通过基因共表达分析发现,EREG在成纤维细胞中与35个蛋白编码mRNA和2个长链非编码RNA存在共表达关系,其中KLK7、TACl、S100B、TMPRSS2、FUT3、SPRR2A等六个基因在前人研究中发现与肿瘤侵袭相关。而我们通过qPCR和WB检测发现,在NF中过表达EREG及用其上清处理口腔鳞癌细胞系后,KLK7的基因和蛋白水平均均显著上调（p<0.05）,说明KLK7可能参与了 EREG介导的CAF促口腔鳞癌侵袭的过程。最后,为了在体内实验中验证以上结论,我们将NF及过表达EREG的NF,CAF及干扰EREG的CAF,分别与口腔鳞癌HSC3细胞系混合注入裸鼠皮下,建立小鼠的口腔鳞癌移植瘤模型。此模型证明,相比于NF,CAF具有显著的促肿瘤生长能力,这种促肿瘤生长能力在EREG被干扰后明显下降,且瘤体内成纤维细胞的CAF标志物SMA表达下降、瘤体侵袭能力标志物MMP2表达下降。相反,在NF中过表达EREG后NF则获得了类CAF的体内促肿瘤生长表型,且成纤维细胞SMA及瘤体MMP2表达上升。以上体内实验结果再次证明了EREG是CAF维持恶性表型及促肿瘤侵袭的关键。另一方面,qPCR及免疫组织化学染色表明,NF中过表达EREG后,其（p-）JAK2、（p-）STAT3、KLK7的表达均升高,印证了以上JAK2-STAT3参与了 EREG介导的NF-CAF转化,及KLK7参与了 EREG介导的CAF促肿瘤侵袭的结论。综上所述,本课题发现高表达EREG的CAF促进口腔鳞癌侵袭和转移,并导致了 口腔鳞癌的不良预后,揭示了 EREG通过JAK2-STAT3通路促进了口腔鳞癌NF恶性表型转化,并通过上调KLK7促进了 CAF促肿瘤侵袭的作用及机制。干扰CAF中EREG的高表达能逆转CAF的恶性表型,抑制其促肿瘤作用,因此高表达的EREG的CAF可能可以作为口腔鳞癌治疗的新靶点,为口腔鳞癌的治疗提供了新思路。