【摘 要】
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目的:观察并探讨氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL）介导的脂氧化损伤对非渗出性和渗出性年龄相关性黄斑变性（Age-Related Macular Degeneration,AMD）致病效应,并阐明丹酚酸A（Salvianolic Acid A,Sal A）抑制视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium,RPE）慢性炎症及脉络膜新生血管（Choroidal Neovascul
【基金项目】
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国家自然科学基金（81674027）； 市科委重点项目（14401972600）； 上海市科委基金； 上海市第一人民医院院内课题；
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目的:观察并探讨氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL）介导的脂氧化损伤对非渗出性和渗出性年龄相关性黄斑变性（Age-Related Macular Degeneration,AMD）致病效应,并阐明丹酚酸A（Salvianolic Acid A,Sal A）抑制视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium,RPE）慢性炎症及脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization,CNV）的分子机制。方法:1.构建大鼠/小鼠高脂氧化损伤模型。实验选择雄性SD大鼠及C57BL6/J小鼠;SD大鼠随机分为对照组、ox-LDL组及ox-LDL联合Sal A注射组;小鼠随机分为正常对照组、ox-LDL组、Sal A注射组及ox-LDL联合Sal A注射组。Ox-LDL组给与尾静脉注射人源性氧化性低密度脂蛋白（4mg/kg）;小鼠Sal A组腹腔注射Sal A（10mg/kg）;ox-LDL+Sal A组（大/小鼠）予以腹腔注射Sal A联合尾静脉注射ox-LDL,对照组尾静脉注射等体积PBS。各组均每日注射一次,连续7日。2.按照上述方法,大鼠静脉给药7天后处死,取眼球石蜡切片,免疫荧光染色观察各组视网膜ox-LDL沉积;TUNEL染色分析视网膜细胞凋亡;ONL/INL检测视网膜感光细胞凋亡。3.建立小鼠脉络膜新生血管模型。按照上述方法诱导小鼠高脂氧化损伤后,麻醉下运用眼底530nm激光构建脉络膜新生血管模型。4.按照上述方法,小鼠激光造模七日后行眼底FFA检查,观察比较各组眼底荧光渗漏情况;摘眼球脉络膜铺片染色比较各组CNV面积;病理切片观察各组CNV病灶高度及宽度。5.诱导ARPE-19细胞脂氧化损伤:ARPE-19细胞随机分为对照组、ox-LDL组及ox-LDL+Sal A组;对照组以无血清培养基处理;ox-LDL组以ox-LDL（100mg/L）处理;ox-LDL+Sal A组以Sal A（5/50uM）预处理三小时,继之以ox-LDL（100mg/L）刺激。细胞培养24小时后检测炎症因子IL-1β/18,TNF-α及MAPK、P2X7R-PKR-NLRP3通路表达;同时分析Sal A对Nrf2蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路的调控。6.诱导ARPE-19及HUVECs细胞脂氧化损伤（同上）。细胞培养48小时后检测血管生成调控因子、ZO-1及CYLD蛋白表达并比较各组HUVECs细胞管腔形成长度,并探讨CYLD蛋白调控新生血管的机制。结果:1.动物尾静脉注射ox-LDL 7天后血清总脂蛋白及ox-LDL浓度升高,免疫荧光证实ox-LDL沉积于视网膜并导致视网膜细胞凋亡;Sal A预处理能有效抑制ox-LDL诱导的血清脂蛋白浓度升高、视网膜脂质沉积和细胞凋亡。2.激光诱导小鼠CNV 7日后ox-LDL组眼底FFA荧光渗漏程度及4级荧光面积高于PBS组;病理切片及脉络膜铺片染色证实ox-LDL组CNV面积和高度均高于PBS组;Sal A预处理能有效减小CNV病灶和视网膜荧光渗漏范围。3.Ox-LDL刺激ARPE-19细胞24小时促进IL-1β/18,TNF-α表达并激活MAPK和P2X7R-PKR-NLRP3通路介导细胞炎症;Sal A预处理诱导Nrf2蛋白表达并激活PI3K/AKT/mTOR通路抗氧化损伤。4.Ox-LDL刺激ARPE-19细胞48小时促进VEGF/PDGF表达,破坏细胞紧密连接（ZO-1）,并促进HUVECs细胞管腔形成;Sal A预处理下调VEGF/PDGF并上调Anti-angiostatin水平,保护RPE细胞紧密连接并抑制HUVECs管腔形成。5.Ox-LDL活化CYLD加剧激光诱导的CNV发展;Sal A预处理下调CYLD水平并促进P62-CYLD-TRAF6结合以抑制CNV发展。结论:1.尾静脉注射ox-LDL可诱导动物高脂模型用于干性AMD患者RPE细胞氧化损伤和慢性炎症机制研究。2.高脂氧化损伤介导RPE细胞慢性炎症,Sal A保护视网膜抗脂氧化损伤和慢性炎症。3.高脂氧化损伤加剧激光诱导的CNV进展;Sal A可抑制CNV发展。4.高脂氧化损伤激活CYLD促新生血管生成;Sal A下调CYLD并促进P62-CYLD-TRAF6结合抑制新生血管形成。5.Sal A具有潜在的治疗AMD疾病临床应用价值。
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