苏云金芽胞杆菌是一种非常重要的微生物杀虫剂,但存在一些缺点,如杀虫作用缓慢、晶体蛋白不稳定等。而提高蛋白晶体表达量和阻止母细胞裂解从而不能释放出晶体蛋白,成为有效提高杀虫活性的解决办法。前期发现影响母细胞裂解的关键水解酶CwlC,受到σ^K因子的控制和GerE的正调控。是否存在其他的转录因子调控cwlC的启动和转录。本研究目的在于寻找母细胞裂解关键水解酶的转录调控因子。根据实验室前期数据分析,选四个转录因子为HD73₁186、HD73₁919、HD73₀806、HD73₂081。前期利用生物信息学分析,发现HD73₁186、HD73₁919、HD73₀806、HD73₂081均为转录因子。利用重叠PCR的方法成功构建出了突变载体pRN5101₁186、pRN5101₁919、pRN5101₀806、pRN5101₂081,利用同源重组高温筛选,成功敲除HD73中的HD73₁186、HD73₁919和HD73₂081基因,筛选出插入突变菌株HD（?1186）、HD（?1919）和HD（?2081）。测定β半乳糖苷酶发现,转录因子HD73₁186和HD73₁919不调控cwlC基因的转录。利用光学显微镜发现突变株HD（?1186）、HD（?1919）和HD（?2081）均与野生型HD73无差别,说明HD73₁186、HD73₁919和HD73₂081基因的缺失不影响母细胞的裂解。利用生物信息学分析发现HD73₁186可能参与甘油代谢的调控,通过RT-PCR发现HD73₁186基因簇的转录单元为:HD73₁186与HD73₁187共同转录,HD73₁188与HD73₁189共同转录,HD73₁190单独转录。成功构建了P₁₁₈₆启动子连接pHT304-18Z的表达载体pHTP₁₁₈₆,分别转化到野生型HD73与突变株HD（?1186）,测定其β半乳糖苷酶,结果表明HD73₁186基因的转录不受转录因子HD73₁186控制。同样,成功构建了P₁₁₈₇启动子连接pHT304-18Z的表达载体pHTP₁₁₈₇,分别电击转化到野生株HD73与突变株HD（?1186）,β半乳糖苷酶分析发现HD73₁187基因的缺失不影响P₁₁₈₇启动子的转录活性,说明HD73₁186和HD73₁187共用一个启动子。测定其生长曲线、芽胞形成率,发现野生型HD73和突变体HD（Δ1186）中均没有明显的差异。测定甘油利用的生长曲线,说明HD73₁186基因缺失并没有影响菌株对甘油的利用。经过生物信息学对HD73₁919上下游基因功能分析,发现HD73₁919可能与Fe³⁺的利用有关。测定生长曲线后发现,HD73₁919基因的缺失不影响菌株的生长。实验室前期研究中发现,与母细胞裂解相关的结合蛋白SpoIIID。于是,想到了是否影响母细胞裂解的关键水解酶基因cwlC的转录调控。构建P_cwlC启动子连接pHT304-18Z的表达载体pHTP_cwlC,再将其分别电击转化到野生型HD73和突变体HD（ΔspoIIID）中。通过β-半乳糖苷酶分析发现P_cwlC启动子在HD(pHTP_cwlC)菌株中的活性低于在Δ(pHTP_cwlC)菌株中的活性,结果表明spoIIID基因的缺失可以影响P_cwlC启动子的转录活性,说明cwlC基因转录受SpoIIID的正调控。本课题成功构建了四个插入突变载体,成功筛选到突变体菌株HD（Δ1186）、HD（Δ1919）和HD（Δ2081）,为遗传改良提供了重要的理论依据,有望构建出新型的Bt工程菌。