论文部分内容阅读
犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的传染犬科动物的，高度接触性、致死性疾病，以出血性肠炎和亚急性心肌炎为特征。犬细小病毒病主要通过粪-口途径传播，幼犬最易感染。目前，犬细小病毒病已经在我国广泛流行，严重威胁着我国的养犬业和皮毛动物养殖业。疫苗接种是防控犬细小病毒病的最有效方法。犬细小病毒病灭活疫苗只能诱导一个短期的免疫反应;由于新的抗原变异毒株的出现，弱毒疫苗接种有时会出现免疫失败。 随着反向遗传技术的发展和成熟，单股负链RNA病毒成为了疫苗载体的研究热点。犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引发的感染多种动物的急性致死性传染病，给我国的犬养殖业和毛皮动物业造成了严重的损失。目前，全世界应用最为广泛的犬瘟热疫苗是弱毒疫苗。利用犬瘟热弱毒疫苗为载体，研制犬细小病毒病、犬瘟热二联活载体疫苗，可实现一苗两防，降低疫苗生产成本，也可针对新出现的抗原变异亚型毒株快速地进行疫苗更新。 按照哺乳动物的密码子偏好性对外源抗原蛋白基因进行密码子优化，能够提高该蛋白在哺乳动物体内或细胞内的表达量，为提高疫苗的免疫效力提供了新的方法。本研究，利用本实验已建立的CD弱毒疫苗株CDV/R-20/8的反向遗传技术平台，构建了表达密码子优化CPVVP2蛋白的重组犬瘟热病毒r20/8-CPVVP2opti。免疫荧光实验和Western blot实验表明，重组病毒r20/8-CPVVP2opti感染的BHK-21细胞中，CPVVP2蛋白得到了正确表达。重组病毒r20/8-CPVVP2opti保持了亲本毒株r20/8在Vero细胞上的生长特性，经实验测定具有生长滴度高的特点，其最高生长滴度可达到106.75 TCID50/ml。Western blot证实，密码子优化可显著提高CPVVP2蛋白在重组犬瘟热病毒r20/8-CPVVP2opti感染细胞中的表达量。以表达密码子优化CPVVP2蛋白重组犬瘟热病毒r20/8-CPVVP2opti表达野生型CPVVP2蛋白重组犬瘟热病毒r20/8-CPVVP2和亲本毒株r20/8分别按104.5 TCID50/100μl/只的剂量以肌肉注射的方式，两次免疫接种小鼠。r20/8-CPVVP2opti、r20/8-CPVVP2和r20/8免疫小鼠，均诱导低水平的CDV中和抗体反应，且3组免疫小鼠血清中CDV中和抗体滴度无显著性差异;然而，r20/8-CPVVP2opti、r20/8-CPVVP2免疫小鼠，均可诱导显著的CPV血凝抑制(HI)抗体反应，加强免疫后1周，CPVHI抗体反应显著增强，且r20/8-CPVVP2opti免疫小鼠血清中CPV HI抗体滴度显著地高于r20/8-CPVVP2免疫小鼠免疫小鼠血清中CPV HI抗体滴度。结果表明，利用密码子优化CPVVP2蛋白基因构建CPV、CDV活载体疫苗，能增强在免疫动物体内诱导的CPV HI抗体反应，有助于提高该疫苗抗CPV感染的免疫效力。 本研究结果表明，表达密码子优化CPVVP2蛋白重组CDV r20/8-CPVVP2opti具有良好的免疫原性，具有作为预防犬细小病毒病和犬瘟热二联活载体疫苗的潜力。