论文部分内容阅读
目的:目前,多项研究发现具有闭合环形结构的环状RNA(circRNA)作为一种内源性非编码RNA(ncRNA)参与着肝癌、鼻咽癌、肺癌及食管癌等多种肿瘤的发生发展过程。ZHAO等人研究发现circ-HOMER1参与肝癌的发生发展,其在肝癌细胞高表达,通过调控下游作用位点miR-1322及CXCL6促进肝癌细胞增殖、侵袭及迁移[1]。Circ-HOMER1在结直肠癌中尚无相关报道,我们课题组前期研究发现circ-HOMER1在结直肠癌组织较癌旁组织中表达水平升高。故针对消化系统高发肿瘤结直肠癌,本课题组设计了一系列实验,旨在探索circ-HOMER1在结直肠癌(CRC)组织和细胞系中的分子调控机制。方法:1、qRT-PCR(Quantitative real-time-polymerase chain reaction)技术检测16对肿瘤组织及癌旁组织标本中circ-HOMER1的表达水平。2、使用X~2检验分析CRC患者的临床特征(癌细胞分化程度、淋巴结转移情况、癌组织浸润肠壁深度、癌症的TNM分期、患者的性别以及年龄)与circ-HOMER1表达水平两者之间的关系(P<0.05时差异有统计学意义)。3、在正常肠上皮细胞系NCM460以及结直肠癌细胞系DLD1、SW620中,通过qRT-PCR技术检测circ-HOMER1的表达水平,发现在DLD1细胞系中,circ-HOMER1差异表达最显著,故选择DLD1细胞系进行下一步实验。4、根据circ-HOMER1序列设计si RNA及其对照,在DLD1细胞系中进行细胞转染及细胞功能学实验。采用CCK-8、克隆形成实验、Transwell及划痕实验分别检测细胞的增殖能力、克隆活性、侵袭力及转移能力。5、circ-HOMER1的下游作用位点使用生物信息学方法预测,结果为miR-513a-3p及KRAS。在成功转染circ-HOMER1 si RNA的DLD1细胞系中测定miR-513a-3p表达水平的变化,KRAS的表达水平的测定包括m RNA和蛋白两个方面。6、根据circ-HOMER1及KRAS序列与miR-513a-3p互补配对的区域,设计合成野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,并使用双荧光素酶报告实验验证circ-HOMER1与miR-513a-3p,miR-513a-3p与KRAS的靶向结合作用。7、使用SPSS Statistics 26.0及Graphpad8.0软件对结果进行统计分析处理并作图。两组定量资料的比较应用t检验,以比较所分析参数的平均值。应用单因素方差分析比较多组正态分布数据间组间差异。通过卡方检验分析circ-HOMER1表达水平与CRC临床特征的关系。用平均值±标准差(mean±SD)表示分析所得结果(当P<0.05时认为差异具有统计学意义)。结果:1、CRC组织及细胞系中circ-HOMER1高表达16对临床标本qRT-PCR结果显示:结直肠癌组织中circ-HOMER1较其配对的癌旁组织表达上调。结直肠癌细胞系DLD1、SW620中circ-HOMER1的表达含量较正常肠上皮细胞系NCM460显著升高(P<0.05),且DLD1细胞系的差异表达最显著。ROC曲线评估circ-HOMER1表达在区分CRC与正常组织中的预测能力,结果显示ROC曲线下面积(AUC)为0.7539,其中95%置信区间为0.5816–0.9263(P=0.0143)。以上结果证实了circ-HOMER1在CRC肿瘤组织中高表达,提示circ-HOMER1可能作为CRC潜在的诊断标志物。2、CRC患者中,circ-HOMER1的表达与以下临床特征无关X~2检验分析发现circ-HOMER1的表达与CRC患者的临床特征(癌细胞分化程度、淋巴结转移情况、癌组织浸润肠壁深度、癌症的TNM分期、患者的性别以及年龄)无关(P>0.05)。3、降低circ-HOMER1的表达水平能抑制CRC细胞在增殖,侵袭和迁移方面的能力成功设计了两个特定的干扰序列(si RNA-1和si RNA-2)来阻断DLD1细胞系中circ-HOMER1的表达。CCK-8、克隆形成实验及、Transwell及划痕实验结果表明,降低circ-HOMER1的表达水平能抑制CRC细胞在增殖,侵袭及迁移方面的能力。4、miR-513a-3p及KRAS是circ-HOMER1的下游作用位点生物信息学方法预测到circ-HOMER1的下游作用位点是miR-513a-3p,miR-513a-3p的下游靶基因是KRAS。在敲低circ-HOMER1的DLD1细胞系中,qRT-PCR检测miR-513a-3p的表达,KRAS的表达使用qRT-PCR和Western blotting检测。结果显示miR-513a-3p表达水平显著上调,KRAS在m RNA和蛋白水平上的相对表达水平均显著下调。5、CRC细胞系中的circ-HOMER1/miR-513a-3p/KRAS轴生物信息学分析软件构建出circ-HOMER1/miR-513a-3p/KRAS调控轴,根据circ-HOMER1及KRAS序列与miR-513a-3p互补配对的区域,设计合成野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,circ-HOMER1与miR-513a-3p,miR-513a-3p与KRAS的靶向结合作用使用双荧光素酶报告实验进行验证。综上我们证实了circ-HOMER1可通过circ HOMER1/miR-30a-5p/KRAS轴增强结直肠癌细胞的增殖能力、侵袭能力及转移能力。Circ-HOMER1有望成为诊断和治疗CRC的标志物和重要靶标,也为详细阐明结直肠癌的分子机制提供了理论和实验依据。结论:1、CRC组织及细胞系中circ-HOMER1高表达,并且circ-HOMER1可能作为CRC诊断的潜在标志物。2、X~2检验分析发现circ-HOMER1的表达与CRC患者的临床特征(癌细胞分化程度、淋巴结转移情况、癌组织浸润肠壁深度、癌症的TNM分期、患者的性别以及年龄)无关(P>0.05)。3、体外细胞功能实验证实了circ-HOMER1可作为致癌因子促进肠癌细胞的增殖及侵袭。4、从机制上阐述了circ-HOMER1可通过circ-HOMER1/miR-513a-3p/KRAS轴调节结直肠癌增殖及侵袭。