研究背景:随着生活节奏、人口老龄化的加速以及膳食结构的改变,全球患慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）的人数不断增加。作为全球的公共卫生问题,CKD给国家和社会带来极大的经济和医疗负担[1]。如不及时治疗,CKD最终会进展为终末期肾病[2],这将大幅增加医疗负荷,因为这些患者需要肾脏替代治疗包括肾移植或透析等才能存活。病理特征如肾间质纤维化、肾小管萎缩和周围毛细血管稀少是CKD的主要标志[3]。肾间质纤维化是各种病因导致的CKD的常见共同途径,也是终末期肾病的主要病理变化[4]。肾间质纤维化是一种由成纤维细胞过度增殖和细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）沉积所导致的过程,伴有肾小管萎缩和炎性细胞浸润[5]。研究表明,纤维化过程由多种细胞类型之间的串扰触发和协调引起,包括肾小管上皮细胞、间充质细胞、炎症细胞和内皮细胞[6]。上皮细胞-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）被描述为受损肾小管上皮细胞经历表型变化从而获得间充质特征,已广泛被接受为肾间质纤维化的典型机制,导致肾间质纤维化的发展[7]。此外,分子事件包括成纤维细胞增殖、巨噬细胞活化和内皮细胞耗竭等病理特征概括了肾间质纤维化发病机制中的关键[8]。尽管有大量的文献进行了深入和广泛的机制研究,但目前肾间质纤维化的发生发展机制尚不明确,暂无有效的治疗肾间质纤维化的方法。因此,我们致力于探索具有潜在治疗的靶点,以期为减轻慢性肾脏疾病的负担做出贡献。环状RNA（ciraclar RNA,circ RNA）被归类为一大类主要的内源性非编码RNA,是由前体m RNA“反向剪接”产生的共价闭环[9]。circ RNA已成为RNA生物学领域的新研究热点,大多数circ RNA在不同物种中是稳定和保守的。尽管先前的观点认为circ RNA是初级转录本剪接后的无用产物。随着高通量RNA测序技术的不断发展,新出现的证据表明circ RNA能够参与包括心血管疾病[10]、神经退行性疾病[11]、代谢疾病[12]以及肿瘤[9]等各种疾病的病理生理过程。circ RNA在细胞增殖、凋亡和衰老等多种生物过程中发挥着重要作用,并已被鉴定和证明为疾病诊断和治疗潜在靶点[13,14]。此外,随着circ RNA在功能上被广泛认识,它们已成为治疗器官纤维化的新疗法[15]。例如:Xu等[16]发现circ HIPK3通过促进叉头盒转录因子K2（Forkhead Box K2,FOXK2）依赖性糖酵解方式来调节肺纤维化。在肾间质纤维化方面,circ RNA010383下调可能促进糖尿病肾病的肾间质纤维化进展[17];Yi等发现circ RNA30032可通过介导miR-96-5p/肝素结合性表皮生长因子（Heparin Binding EGF Like Growth Factor Gene,HBEGF）/癌基因（Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene,KRAS）轴诱导肾间质纤维化的发生[18]。此外,有研究发现circ-Ankib1可以通过控制肉瘤细胞中干扰素相关基因和促炎因子的表达,从而促进肿瘤发生[19]。circ-Ankib1还可以调节周围神经损伤后的施万细胞增殖[20]。生物信息学分析表明circ-Ankib1在肾间质纤维化中被下调[21]。然而,关于circ-Ankib1在肾脏疾病中的作用尚不明确。在本研究中,我们首次关注circ-Ankib1是否在肾脏中具有抗纤维化作用。微RNA（micro RNA,miRNA）是长约22nt的非编码RNA,能在转录后通过m RNA降解或翻译抑制控制目标基因表达[22]。先前的研究表明miR-449a能通过赖氨酸氧化酶3（Lysyl Oxidase Like 3,LOXL3）/雷帕霉素靶蛋白（m TOR）轴促进心脏纤维化[23]。我们通过Starbase软件确定了circ-Ankib1与miR-449a之间存在结合位点,预测两者之间具有潜在的相互关系。此外,miR-449a能够靶向Bcl2调节自噬促进肺纤维化[24]。然而,circ-Ankib1是否通过miR-449a参与肾间质纤维化仍需进一步研究。Krüppel样因子4（Krüppel-like Factor 4,Klf4）是一种具有进化上保守的锌指蛋白,可作为参与调节细胞增殖、分化和凋亡等多种作用的转录因子。研究表明,在单侧输尿管梗阻的小鼠模型中证明了Klf4的表达在肾间质纤维化中降低,其可以通过抑制炎症来调节肾间质纤维化,表明Klf4在肾脏中的抗纤维化作用[25,26]。巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage Migration Inhibitory Factor,MIF）和单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1）是与肾脏疾病相关的重要炎症细胞因子,Klf4通过消除转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）诱导的人肾小管细胞中MIF和MCP-1的产生来减少炎症[27]。线粒体融合蛋白2（Mitofusin2,Mfn2）是一种位于线粒体外膜上的跨膜多功能蛋白,能参与各种生物过程。巨噬细胞Mfn2的下调可导致巨噬细胞极化并向促纤维化表型转化[28]。研究发现,在5/6肾切除术大鼠模型中,吡格列酮促进Mfn2的上调,从而发挥肾脏保护作用[29]。Klf4/Mfn2轴在肾间质纤维化中的作用已得到证明[30]。我们通过生物信息学预测miR-449a可能直接与Klf4 m RNA结合。因此,本研究假设circ-Ankib1可能通过miR-449a参与肾间质纤维化,并且miR-449a结合下游转录因子Klf4/Mfn2参与肾间质纤维化。总之,在本研究中我们旨在全面探索circ-Ankib1靶向miR-449a/Klf4/Mfn2轴在抑制肾间质纤维化发展的机制,为发现肾间质纤维化的潜在治疗靶点提供见解。第一部分:circ-Ankib1在肾间质纤维化中的功能目的:确定circ-Ankib1在肾间质纤维化中的作用。方法:1.首先,设计了扩增的circ-Ankib1的聚合引物。RNase R处理小鼠肾小管上皮细胞（Transformed C3H Mouse Kidney-1,TCMK-1）明确circ-Ankib1的表达的影响。在取得患者知情同意后,从我院住院患者中选取了12例未经治疗的CKD确诊患者,并通过肾穿刺收取这些患者肾脏标本（CKD组）,同时选取8例遭遇车祸患者正常肾组织作为正常对照组。实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR,qRT-PCR）比较两组circ-Ankib1的相对表达水平,Western blotting检测两组肾组织样本的纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、Ⅳ型胶原（Collagen TypeⅣ,COLⅣ）、纤连蛋白（Fibronectin,FN）的表达。2.qRT-PCR比较10ng/ml浓度的TGF-β1诱导的TCMK-1细胞中circAnkib1的相对水平,Western blotting检测10ng/ml浓度的TGF-β1诱导的TCMK-1细胞中纤维化和相关蛋白（?）-SMA、COLⅣ、FN的表达。3.将体外培养的TCMK-1细胞分为以下四组:正常对照组（未经处理的TCMK-1细胞）;TGF-β1组（10ng/ml TGF-β1诱导的TCMK-1细胞）;TGF-β1+oe-NC组（10ng/ml TGF-β1诱导的转染pc DNA3.1的TCMK-1细胞）;TGF-β1+oe-circ-Ankib1组（10ng/ml TGF-β1诱导的转染重组质粒pc DNA3.1 circ-Ankib1的TCMK-1细胞）;qRT-PCR比较转染oe-NC和oe-circ-Ankib1在TCMK-1细胞及各组细胞circ-Ankib1相对水平,Western blotting检测各组细胞EMT相关蛋白（?）-SMA、COLⅣ、FN的水平。4.构建UUO小鼠模型,将小鼠分为假手术（Sham）组、UUO组、过表达阴性对照UUO组（UUO+oe-NC）、过表达circ-Ankib1 UUO组（UUO+oe-circAnkib1）;qRT-PCR比较这4组中肾组织中的相对circ-Ankib1水平;观察4组中肾组织Masson染色图像;Western blotting检测各组肾组织中纤维化和EMT相关蛋白（?）-SMA、COLⅣ、FN的水平,免疫组织化学分析检测各组肾组织中纤维化相关蛋白（?）-SMA、COLⅣ、FN的表达。结果:1.我们设计了circ-Ankib1的特异性引物。使用RNase R处理TCMK-1细胞显著抑制Ankib1的表达,而RNase R对circ-Ankib1的表达没有明显影响。与正常肾组织相比,CKD患者肾组织中的circ-Ankib1显著下调。2.TGF-β1（10ng/ml）下调了TCMK-1细胞中circ-Ankib1的表达,并且显著增加（?）-SMA、COLⅣ、FN蛋白水平。3.qRT-PCR显示TGF-β1诱导的circ-Ankib1减少可因转染circ-Ankib1被逆转;Western blotting结果显示circ-Ankib1的过度表达下调了TGF-β1诱导的（?）-SMA、COLⅣ、FN水平高表达。4.与正常小鼠相比,UUO小鼠观察到circ-Ankib1水平的降低;相较于oeNC对照组,注射circ-Ankib1质粒小鼠肾脏中的circ-Ankib1水平显著增加;Masson染色观察到,相较于Sham组,UUO组的肾组织中观察到显著的肾间质纤维化,circ-Ankib1的过表达大大抑制了UUO引起的纤维化;Western blotting发现UUO组（?）-SMA、COLⅣ、FN表达增加,而circ-Ankib1的过表达逆转了（?）-SMA、COLⅣ、FN的高表达;免疫组织化学分析具有相同的结果,表明UUO组肾组织中（?）-SMA、COLⅣ、FN表达增加,circ-Ankib1的过度表达抑制这种变化。结论:circ-Ankib1抑制EMT和肾间质纤维化。第二部分:miR-449a/Klf4在肾间质纤维化中的作用目的:明确miR-449a/Klf4相互作用在肾间质纤维化中的作用。方法:1.qRT-PCR检测CKD患者肾组织和正常肾组织及10ng/ml TGF-β1处理后TCMK-1细胞中miR-449a表达水平。2.体外培养的TCMK-1细胞,分别转染miR-NC、miR-449a inhibitor。实验分组为:Control组、TGF-β1组、TGF-β1+miR-NC组和TGF-β1+miR-449a inhibitor组,qRT-PCR检测各组纤维化相关蛋白的水平。3.RT-PCR和Western blotting检测Control组和TGF-β1组的Klf4和Mfn2表达水平。体外培养的TCMK-1细胞分别转染oe-NC、oe-Klf4,实验分组为:Control组、TGF-β1组、TGF-β1+oe-NC组和TGF-β1+oe-Klf4组,qRT-PCR和Western blotting检测各组纤维化相关蛋白的水平。4.生物学信息软件和双荧光素酶预测及证明miR-449a与Klf4之间存在互补结合位点;体外培养的TCMK-1细胞,分别转染miR-NC、miR-449a inhibitor,实验分为3组:TGF-β1组、TGF-β1+miR-Nc组和TGF-β1+miR-449a inhibitor组。qRT-PCR检测各组组Klf4的水平,Western blotting检测各组Klf4和Mfn2水平。5.生物学信息软件和双荧光素酶预测及证明Klf4与Mfn2具有潜在的结合位点;体外培养的TCMK-1细胞,分别转染oe-NC、oe-Klf4、sh-NC和sh-Klf4,实验分组为,oe-NC组、oe-Klf4组、sh-NC组和sh-Klf4,qRT-PCR检测各组Mfn2的水平。6.体外培养10ng/ml TGF-β1诱导TCMK-1,将细胞分为五组:正常对照组（未经处理的TCMK-1细胞）;TGF-β1组（10ng/ml TGF-β1诱导的TCMK-1细胞）;TGF-β1+miR-449a inhibitor组（10ng/ml TGF-β1诱导的转染miR-449a抑制剂的TCMK-1细胞）;TGF-β1+miR-449a inhibitor+sh-NC组（10ng/ml TGF-β1诱导的转染miR-449a抑制剂的sh-NC TCMK-1细胞）;TGF-β1+miR-449a inhibitor+sh-Mfn2组（10ng/ml TGF-β1诱导的转染miR-449a抑制剂的sh-Mfn2TCMK-1细胞）,qRT-PCR和Western blotting检测各组细胞中EMT相关蛋白（?）-SMA、COLⅣ、FN的水平及Klf4、Mfn2蛋白水平。7.构建UUO小鼠模型,分为以下四组:Sham组、UUO组、antago miRNC UUO组（UUO+miR-NC）、antago miR-449a UUO组（UUO+miR-449a inhibitor）,qRT-PCR、Western blotting检测注射miR-449a inhibitor小鼠的肾组织中miR-449a、Klf4、Mfn2的相对水平。Western blotting检测各组肾组织中纤维化标记物（?）-SMA、COLⅣ、FN的水平。免疫组化检测EMT相关蛋白表达的水平。Masson染色图像比较各组肾组织纤维化情况。结果:1.与正常对照组相比,CKD患者中miR-449a表达水平升高;TGF-β1增加TCMK-1细胞中miR-449a水平。2.与Control组相比,TGF-β1处理后的TCMK-1细胞miR449a明显升高。TGF-β1处理后增加的（?）-SMA、FN、COLⅣ的蛋白水平被转染miR-449a inhibitor逆转。3.与Control组相比,TGF-β1组Klf4和miR449a明显下降。转染oe-Klf4的TCMK-1细胞（?）-SMA、FN、COLⅣ的蛋白水平较TGF-β1组明显下降。4.miR-449a模拟物可以显著减少了Klf4-WT的荧光素酶活性,然而其对突变型Klf4未见明显改变;Klf4预测为miR-449a的下游m RNA;转染miR-449a inhibitor的TCMK-1细胞Klf4和Mfn2的水平显著升高。5.Klf4能够转录激活Mfn2;过表达Klf4提升TCMK-1细胞中Mfn2的m RNA水平,相反sh-Klf4抑制Klf4的表达能使Mfn2的m RNA水平下降。6.TGF-β1诱导的TCMK-1细胞miR-449a表达上调,Klf4和Mfn2表达下调,转染miR-449a抑制剂可逆转TGF-β1诱导上述变化,转染miR-449a抑制剂的TGF-β1诱导再次使用sh-Mfn2抑制Mfn2的表达的TCMK-1细胞中miR-449a、Klf4明显变化,Mfn2显著下调。Western blotting结果显示,TGF-β1诱导的TCMK-1细胞（?）-SMA、COLⅣ、FN蛋白水平表达上调;转染miR-449a抑制剂可逆转TGF-β1诱导的（?）-SMA、COLⅣ、FN蛋白水平表达上调,而在转染miR-449a抑制剂的TGF-β1诱导的TCMK-1细胞中,使用sh-Mfn2抑制Mfn2的表达,可上调（?）-SMA、COLⅣ、FN蛋白水平表达。7.UUO小鼠miR-449a表达升高,Klf4和Mfn2表达下降;注射miR-449a inhibitor的小鼠miR-449a的表达大大降低;Masson染色观察到miR-449ainhibitor组显著减轻UUO引起的肾间质纤维化和损伤;Western blotting结果显示,miR-449a inhibitor组能显著抑制UUO诱导的（?）-SMA、COLⅣ、FN表达增加。此外,UUO模型中降低的Klf4和Mfn2水平可被miR-449a ainhibitor显著恢复。结论:miR-449a靶向Klf4/Mfn2促进纤维化和EMT。第三部分:circ-Ankib1靶向miR-449a/Klf4/Mfn2轴在肾间质纤维化中的作用目的:探讨circ-Ankib1是否通过“海绵”miR-449a抑制纤维化的作用,且miR-449a是否靶向下游的Klf4/Mfn2轴参与肾间质纤维化过程。方法:1.生物信息学分析发现circ-Ankib1和miR-449a之间的互补结合位点。2.RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）实验观察circ-Ankib1和miR-449a的相对富集。3.体外培养的TCMK-1细胞分为3组:Control组、oe-NC组（转染oe-NC的TCMK-1细胞）、oe-circ-Ankib1组（转染oe-circ-Ankib1的TCMK-1细胞）,qRT-PCR检测各组细胞相对circ-Ankib1、miR-449a水平。4.体外培养的TCMK-1细胞分为以下五组:Control组（未经处理的TCMK-1细胞）、TGF-β1组（10ng/ml TGF-β1诱导的TCMK-1细胞）、TGF-β1+oe-circ-Ankib1组（10ng/ml TGF-β1诱导的转染重组质粒pc DNA3.1 circ-Ankib1的TCMK-1细胞）、TGF-β1+oe-circ-Ankib1+miR-NC组（10ng/ml TGF-β1诱导的转染重组质粒pc DNA3.1 circ-Ankib1及mimics NC的TCMK-1细胞）、TGF-β1+oe-circ-Ankib1+miR-449a mimics组（10ng/ml TGF-β1诱导的转染重组质粒pc DNA3.1 circ-Ankib1及miR-449a mimics的TCMK-1细胞）,qRT-PCR检测各组细胞circ-Ankib1、miR-449a、Klf4、Mfn2 m RNA的水平,Western blotting检测各组细胞中纤维化蛋白（?）-SMA、COLⅣ、FN,以及Klf4、Mfn2蛋白的水平。5.构建UUO小鼠模型,将小鼠分为Sham组、UUO组、UUO+oe-NC组、UUO+oe-circ-Ankib1组,qRT-PCR检测各组小鼠circ-Ankib1、miR-449a、Klf4和Mfn2的相对水平,Western blotting检测各组小鼠Klf4和Mfn2蛋白水平。结果:1.生物信息学分析显示circ-Ankib1和miR-449a之间存在的互补结合位点。2.RNA免疫沉淀发现AGO2抗体的免疫沉淀显著富集circ-Ankib1和miR-449a;双荧光素酶分析观察到miR-449a模拟物极大地降低了circ-Ankib1-wt的荧光素酶活性,而对突变的circ-Ankib1-MUT无影响。3.circ-Ankib1的过度表达抑制TGF-β1诱导的TCMK-1细胞miR-449a表达。4.TCMK-1细胞中circ-Ankib1的过度表达降低了circ-Ankib1、Klf4、Mfn2的表达,上升了miR-449a的表达。miR-449a和circ-Ankib1的联合过表达上调了miR-449a的表达水平、降低了Klf4、Mfn2的表达,而对circ-Ankib1无明显影响。TCMK-1细胞中circ-Ankib1的过度表达逆转了TGF-β1诱导的TCMK-1细胞（?）-SMA、COLⅣ、FN蛋白的上调,miR-449a和circ-Ankib1的联合过表达再次上调了（?）-SMA、COLⅣ、FN的表达。5.与Sham组相比,观察到UUO组的miR-449a增加,circ-Ankib1、Klf4和Mfn2均显著减少。过表达circ-Ankib1抑制了UUO诱导的miR-449a的增加,恢复了Klf4和Mfn2的表达。结论:circ-Ankib1通过靶向miR-449a抑制肾间质纤维化和EMT,miR-449a直接靶向抑制Klf4/Mfn2轴。