纤维素是自然界中丰富的可再生资源,利用纤维素酶降解纤维素,转化获得生物燃料和化工产品,能够保护环境、促进经济可持续发展。在纤维素酶生产菌株中,丝状真菌能够分泌完整的纤维素降解酶组分。探索其纤维素酶合成调控的关键因子,阐明纤维素酶合成的调控网络,将为菌株的遗传改造提供合理的靶点,对于提高酶的产量和降低成本具有重要的现实意义。据报道,假定的甲基转移酶LaeA/LAE1调控丝状真菌发育、纤维素酶基因及次级代谢基因簇的表达。本论文以甲基转移酶LaeA的功能研究为切入点,筛选LaeA互作蛋白,解析了 LaeA及其互作蛋白、转录因子共同作用激活草酸青霉纤维素酶基因表达的机制。本论文的主要研究结果如下:1.草酸青霉LaeA互作蛋白的筛选使用酵母双杂交技术（Y2H）和串联亲和纯化（TAP）-质谱（LC-MS/MS）技术筛选并鉴定了细胞内与LaeA具有潜在相互作用的蛋白质。使用酵母双杂交技术,筛选草酸青霉cNDA文库,获得4个LaeA候选互作蛋白,包括异染色质蛋白HepA、羧肽酶、信号转导组氨酸激酶和一个未知功能蛋白。使用串联亲和纯化-质谱技术,筛选鉴定到15个LaeA候选互作蛋白,包括VelB/VeA/LaeA复合物中的成员VeA和VelB、葡萄糖阻遏蛋白TUP1/RcoA、S-腺苷甲硫氨酸合成酶A、组蛋白H2B、硝基还原酶、转录调控因子AmyR、延伸因子EF-2、F1FO-ATPase复合物的亚基、分子伴侣DnaK、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶、1-磷脂酰肌醇-4.5-二磷酸二酯酶、6-磷酸果糖-2-激酶、具有假定的钙离子结合活力蛋白和ATP合成酶的β亚基。根据对已有文献报道结果的分析,我们推测其中6个LaeA候选互作蛋白（分别为异染色质蛋白HepA、VeA、VelB、葡萄糖阻遏蛋白TUP1/RcoA、S-腺苷甲硫氨酸合成酶A和组蛋白H2B）可能参与纤维素酶基因表达的调控。2.异染色质蛋白HepA参与染色质凝集,并激活纤维素酶基因表达HepA是利用酵母双杂交技术获得的LaeA互作蛋白,为异染色质蛋白HP1的同源蛋白。HepA缺失菌株（△hepA）与野生型菌株和回补菌株相比,产孢能力大幅度降低。回补草酸青霉hepA（RPohepA）或者构巢曲霉hepA（RAnhepA）基因,可以弥补由敲除hepA造成的缺陷,表明构巢曲霉HepA和草酸青霉HepA在生物学功能上高度保守。HepA实际上也是纤维素酶基因表达的激活因子。△hepA菌株发酵四天后,FPA 酶活（filter paper activity）、CMC 酶活（EG,endoglucanase）、pNPC 酶活（CBH,cellobiohydrolyase）及pNPG 酶活（BG,β-glucosidase）与野生型菌株相比分别下降了 65.6%、77.3%、91.8%和70.1%。过表达hepA菌株发酵四天后,FPA酶活、CMC酶活、pNPC酶活和pNPG酶活分别提高了 2.5倍、2.9倍、2.2倍和11.9倍。利用实时PCR测定染色质可及性（Chromatin Accessibility by Real-Time PCR,CHART-PCR）技术分析了 HepA 介导的染色质结构的变化,对各突变株的纤维素酶基因上游区域染色质结构的变化进行了分析。△hepA菌株中,两种主要纤维素酶基因cel7A/cbh1和cel7B/eg1的启动子区域（核心启动子区及其上游）的染色质结构发生改变。染色质可及系数（Chromatin Accessibility Index,CAI）显著增加,表明HepA是染色质凝聚所必需。3.LaeA-RcoA、RcoA-ClrB具有核内的相互作用,且为草酸青霉纤维素酶基因激活表达所必需RcoA是利用串联亲和纯化-质谱技术鉴定到的LaeA互作蛋白。实验室前期研究发现,RcoA可与纤维素酶转录激活因子ClrB互作。RcoA通常与Cyc8形成复合物,且在真核生物中高度保守。利用双分子荧光互补（BiFC）技术对RcoA与ClrB、LaeA、Cyc8的相互作用进行确认和亚细胞定位,并对LaeA是否与ClrB、Cyc8具有细胞内的相互作用开展了研究,结果显示:（1）LaeA与RcoA具有相互作用,且发生在细胞核内;（2）ClrB与RcoA具有相互作用,且发生在细胞核内;（3）RcoA与Cyc8具有相互作用,且发生在细胞核内;（4）LaeA与ClrB不具有胞内相互作用;（5）LaeA与Cyc8不具有胞内相互作用;（6）ClrB与Cyc8不具有胞内相互作用。对三个蛋白ClrB、RcoA和LaeA敲除株和过表达菌株的产孢能力及纤维素酶合成能力的分析,发现RcoA和LaeA可调控草酸青霉的发育,而ClrB的敲除和过表达不影响草酸青霉的产孢能力。敲除rcoA可大幅度地降低纤维素酶的合成能力,30℃培养5天后,FPA酶活、CMC酶活、pNPC酶活及pNPG酶活分别降低了 86.5%、59.4%、72.0%及57.7%。分别敲除laeA和clrB,主要纤维素酶基因的转录水平及纤维素酶活力均大幅度降低。构建了双突变菌株 △laeAOEclrB、OEclrB△rcoA、△clrBOElaeA及 △clrBOErcoA。测定纤维素酶酶活,结果显示:30℃培养5天后,△laeAOEclrB菌株与野生型菌株相比,FPA酶活、CMC酶活、pNPC酶活和pNPG酶活分别下降了 58.2%、67.9%、64.5%和 28.6%;OEclrB△rcoA 菌株分别降低了 93.5%、88.1%、91.4%和 74.2%;△clrBOElaeA 菌株分别下降了 94.2%、98.2%、72.5%和 19.7%;△clrBOErcoA 菌株分别下降了 95.1%、98.8%、77.7%和13.9%。结果表明,草酸青霉ClrB、RcoA、LaeA均为纤维素酶基因激活表达所必需。4.LaeA、RcoA、ClrB激活纤维素酶基因表达的机制研究通过串联亲和纯化的方式获取LaeA粗蛋白液,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,催化重组人源组蛋白H2B。LC-MS/MS鉴定分析发现H2B Lys109和H2B Lys 117发生单甲基化。草酸青霉H2B与人源组蛋白H2B相似性达到61.7%,甲基化位点分别对应为草酸青霉H2B Lys123和H2B Lys 131。于是,我们推测,在草酸青霉中,LaeA具有组蛋白甲基转移酶活性,甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸,通过甲基化组蛋白H2B Lys123和H2B Lys 131行使功能。为了进一步研究H2B甲基化位点的功能,我们构建了 H2B点突变菌株H2BK123A、H2BK131A。结果显示:H2B点突变菌株孢子发育受到严重影响,孢子颜色变浅,且孢子量减少;沉默了菌株多个次级代谢基因簇的表达;并降低了菌株纤维素酶合成能力。同时发现,LaeA,RcoA及ClrB的敲除使得纤维素酶基因cel7A/cbhl和cel7B/eg1的转录水平降低,并伴随着启动子区域的染色质凝聚。在此基础上,我们提出了LaeA、RcoA、ClrB激活纤维素酶基因表达的机制模型:激活转录因子ClrB结合到纤维素酶基因启动子区,招募RcoA-Cyc8复合体,以RcoA为介导招募组蛋白甲基转移酶LaeA,LaeA通过甲基化组蛋白H2B Lys123和H2B Lys 131,改变染色质结构,激活纤维素酶基因的转录。