酯类水解酶能够催化酯键的水解和合成,其广泛存在于植物、动物和微生物中。由于具有广泛的底物特异性、精确的化学选择性和区域选择性、反应不需要辅因子以及在有机溶剂中高度稳定等特性,酯类水解酶在工业上具有十分广泛的应用。糖酯酶是一大类糖类活性酶,能够催化酯类取代基从多糖的糖链上脱离,这些多糖来自于不同生物体,包括微生物多糖肽聚糖、动物多糖几丁质以及植物多糖木聚糖等。一些酯类水解酶还具有糖酯酶的活性。海洋中大部分区域常年处于低温、高压、高盐、黑暗和寡营养中。海洋微生物在适应海洋极端环境的长期过程中,其分泌的胞外有机碳降解酶类已经进化出与海洋环境相适应的特征,如适冷性、耐盐性、耐高压以及独特的底物选择性等。海洋微生物为获取性质独特的具有工业潜力的新酶提供了巨大的资源。宏基因组技术是一种不依赖纯培养的技术,它的应用使得从可培养及不可培养的海洋微生物中获取新的功能基因成为可能。目前有关耐盐酯类水解酶的报道还很少,同时由于缺少三维结构数据,有关耐盐或嗜盐酯类水解酶耐盐的分子机制目前尚不清楚。对其他种类耐盐和嗜盐酶的研究发现,这些酶类可能有多种适盐机制。本论文中,研究了海洋沉积物来源酯酶H8和E40的耐盐机理。同时,还研究了海洋细菌来源的新型糖酯酶H22的催化机制。一、南海深海表层沉积物中酯类水解酶的功能宏基因组筛选构建了南海深海表层沉积物样品Site 63（水深3939 m）和Site 100（水深4240 m）的fosmid宏基因组文库,其中样品Site63的文库含有24,000个fosmid克隆,Site 100含有7,200个fosmid克隆。对文库中的酯类水解酶进行了筛选,共获得66个具有酯类水解酶活性的fosmid克隆。随后,构建了这些阳性克隆的亚克隆文库,并进行筛选及测序,确定了其中11个fosmids（P6-2F、P49-7F、P194-7C、P24-3C、P43-6C、P92-7D、P103-3B、P194-1G、P138-1B、P138-8D、P43-5H）上携带的酯类水解酶基因序列。其中,fosmids P6-2F、P49-7F和P194-7C,fosmids P103-3B和P194-1G分别含有相同的酯类水解酶序列,因此最终得到8条酯类水解酶基因序列,将其分别命名为H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7和H8。通过进一步的序列分析,确定了酯类水解酶所在的蛋白家族。其中,酯类水解酶H1、H4、H5和H7属于酯类水解酶第Ⅶ家族,H2、H3和H6属于酯类水解酶第Ⅳ家族,H8属于酯类水解酶第Ⅴ家族。二、耐盐酯酶H8的生化特性及耐盐机制研究对从南海深海沉积物样品Site 100中筛选到的酯类水解酶基因H8进行了进一步研究,对其进行了异源表达、分离纯化及酶学性质分析。在所有已报道的酯类水解酶中,H8与来源于混合微生物菌群的第Ⅴ家族酯酶Est16具有最高的序列相似性（46%）。系统发育分析也表明H8属于酯类水解酶第Ⅴ家族,其催化三联体分别为Ser120、Asp247和His275。H8能够高效降解短碳链单酯（C4-C10）,其对pNPC6的降解能力最强（69.0U/mg）,其对长碳链pNP酯（C12-C16）的降解能力很弱,这表明H8属于酯酶。H8的最适酶活温度为35℃,最适pH为10.0,其催化反应不需要金属离子作为辅因子。H8具有很高的耐盐性,低于4.0 M的NaCl基本不会导致H8酶活性降低,且H8能稳定存在于4.6MNaCl中,这表明H8对所处海洋含盐环境的适应及其潜在的工业应用潜力。与以往已报道的耐盐/嗜盐酶不同,H8具有更高的碱性/酸性氨基酸残基比和更高的pI值（9.09）。通过在NCBInr数据库中进行同源性搜索,我们找到了超过10条具有高碱性/酸性残基比和高pI值的H8同源序列,表明H8及其同源蛋白可能代表了一个新的第V家族耐盐酯类水解酶类群,这一类群的酶富含碱性氨基酸。基于多序列比对分析,我们选取了 5个保守碱性氨基酸残基位点（Arg195、Arg203、Arg216、Arg236和Arg263）,将其突变成酸性残基Glu以研究碱性残基在H8耐盐性中的作用。通过研究NaCl对H8突变体活性和稳定性的影响,揭示出碱性氨基酸残基Arg195、Arg203和Arg236可能在H8耐盐性中发挥重要作用。三、HSL家族酯酶E40耐盐机制的研究本实验室的前期研究从中国南海表层沉积物样品E505的fosmid文库中筛选到一个HSL家族适冷酯酶E40,并通过引入疏水残基获得了多个热稳定的E40突变体（I203F、S202W/1203F和M3+S202W/1203F）。本部分中,我们对这些E40突变体的耐盐性进行了研究。相较于野生型,E40突变体的耐盐性得到了显著提高,其耐盐性为 M3+S202W/I203F>S202W/I203F>I203F>E40。圆二色谱和荧光光谱分析表明,引入的疏水残基不会影响E40在含盐溶液中的二级和三级结构。但是,通过凝胶过滤分析E40野生型和突变体在溶液中的聚集态发现,突变体M3+S202W/I203F的四级结构要比野生型更稳定。随后,我们对E40的两个耐盐突变体S202W/1203F和M3+S202W/I203F进行了晶体结构解析,研究了其耐盐性提高的结构基础。类似于其他HSL酯酶,E40含有两个结构域,一个CAP结构域和一个催化结构域。结构分析表明,通过向α7中引入疏水残基Trp202和Phe203,增强了 E40催化结构域内Phe203与Trp202间以及Phe203与其他氨基酸残基间的疏水相互作用,进而显著提高了 E40的耐盐性。向突变体S202W/1203F的loop1中进一步引入疏水残基,还会增强CAP结构域中loop1与催化结构域中α7间的疏水相互作用,使突变体M3+S202W/I203F的结构变得更加紧密和稳定,进而提高了其耐盐性。在对海洋高盐环境的适应过程中,多数嗜盐蛋白的表面和内部疏水核心已经进化出含有较少的疏水相互作用。我们的研究则表明,通过增强蛋白结构域内和结构域间的疏水相互作用,能使E40的结构更加紧密和稳定,进而提高其耐盐性。这些结果拓宽了对酶的耐盐机制的了解,有望应用于提高有工业应用潜力的酶蛋白的耐盐性,在蛋白质工程中具有重要的应用价值。四、SGNH家族乙酰木寡糖水解酶H22的生化特性、结构和催化机制研究本实验室保存的菌株Arcticibacterium luteifluviistationis SM1504分离自北极王湾（King’s Fjord,Svalbard）的表层海水。前期已经完成了对这株菌的全基因组测序并进行了相应的基因注释。基于此,我们从其基因组中筛选到了一个编码SGNH家族水解酶基因H22。在已表征的酶蛋白中,H22与来源于Geobacillus stearothermophilus的SGNH家族乙酰木寡糖酯酶Axe2具有最高的序列相似性,仅为24%,这表明H22是一个新型SGNH水解酶。系统发育分析表明,H22及其同源序列可能代表了一个糖酯酶新家族。随后,我们对H22进行了异源表达和分离纯化,并检测了 H22对不同乙酰化寡糖底物的降解能力。结果显示,H22能降解多种乙酰化寡糖,其中对乙酰化木单糖的降解活性最高,为乙酰木寡糖酯酶。TLC分析结果显示,H22对寡糖底物上的乙酰化位点没有选择性。H22的最适反应温度为25℃,且在0-20℃低温保留80%以上的高活力,表明H22是适冷酶。H22的最适反应pH为9.0,其催化反应不需要金属离子作为辅因子。H22还是耐盐酶,其活性不受3.0 M NaCl的影响且能在4.8 MNaCl中稳定存在。为了阐明H22降解乙酰化木糖底物的结构基础,我们解析了 H22及其突变体S18A和产物乙酸复合物的晶体结构,分辨率分别为2.5 A和1.53 A。结构分析并结合突变和生化验证,揭示出Ser18、Asp186和His189组成了 H22的催化三联体,Gly55和Asn84构成了 H22的氧离子洞,提出了 H22降解乙酰化木单糖底物可能的分子机制。