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体外培养的神经元是一项很有价值的研究手段,已广泛用于轴突的导向与再生,突触的形成,基因治疗,组织工程,细胞移植等多项领域。感音神经性聋是耳鼻咽喉头颈外科的一种常见病及多发病,由多种因素造成。目前比较有效的治疗手段为人工耳蜗和助听器,人工耳蜗作用原理是绕过受损的感觉上皮,直接刺激螺旋神经节神经元,从而恢复声音信号的传递。助听器通过放大声音,利用残存的毛细胞,恢复声音的传导。上述治疗办法必须依靠耳蜗内残存有一定数量的毛细胞和螺旋神经节细胞,而部分重度感音神经性聋往往达不到要求。将干细胞植入内耳,诱导使其分化为毛细胞及螺旋神经节细胞,修复损伤神经上皮,从根本上解决感音神经性聋是目前研究方向,从已有的动物实验结果来看,将来有可能成为一种有效的治疗手段。
目的：
本实验旨在建立一套优化的背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)神经元体外分离培养方法,探讨慢病毒转染DRG神经元的可行性,从而通过慢病毒将目的基因转入DRG神经元,为内耳细胞移植研究提供理想的供体。
方法：
①DRG神经元的分离、纯化及培养:摘取14-16天胚胎大鼠的DRG,采用胰酶和胶原酶Ⅱ消化制成单细胞悬液,接种前应用差速贴壁法进行初步纯化；重新收集细胞悬液,按104个/cm2密度接种,应用无血清神经元专用培养基(Neurobasal)进行培养,48h后加入有丝分裂抑制剂阿糖胞苷(CytosineArabinoside,Ara-C),维持48h,换成Neurobasal培养基；相差显微镜下观察神经元在培养过程中的形态学变化,分别于培养第3、5、7天,用显微镜下目测微尺测量神经元胞体直径与轴突的长度；应用神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)对神经元进行免疫细胞化学染色,鉴定神经元,计算视野中染色阳性细胞占所有细胞比例,测定神经元在培养物中的纯度。②携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体(Lentiviral vector-green fluorescent protein,LV-GFP)转染DRG神经元:采取不同的感染复数(Multiplicity of infection,MOI)1、10、50、100,观察LV-GFP转染DRG神经元的情况。实验分为两组,即转染时加入聚凝胺(polybrene)实验组和不加polybrene的实验组；转染后24h开始于荧光显微镜下观察GFP表达情况并计数,同时计数明视野内所有细胞,计算慢病毒的转染效率；判断慢病毒载体转染目的细胞所需的合适MOI值及GFP最佳表达时间等；此外,比较两组之间GFP表达的差异。
结果：
①DRG神经元在体外培养条件下生长良好,最长可以存活6周；差速贴壁法与有丝分裂抑制法相结合,可以得到纯度较高的DRG神经元,纯度能达到(91.12±0.23)％,未用Ara-C纯化的神经元的纯度为(47.21±0.34)％,卡方检验统计分析,两者有显著性差异。②在一定范围内,GFP的表达随MOI的增加而增强,当MOI=50时,DRG神经元表达的GFP最强；MOI=100时,表达效果反而下降；转染后24h,GFP在神经元内开始有表达,转染后第3天,荧光表达效果最强。
结论：
通过原代神经组织体外分离培养法,可以获得高纯度的DRG神经元,且生长状态良好,可以存活较长时间。通过慢病毒载体可以将目的基因GFP高效而稳定地整合入DRG神经元基因组内,并能实现长期稳定表达。本研究能够为内耳细胞移植提供良好的供体。