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马传染性贫血病毒(Equineinfectiousanemiavirus,EIAV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一,在基因组结构和抗原性上与人艾滋病病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)十分相似,可以引起马属动物的一种急性烈性传染病,以贫血、持续感染、反复发热为特征,终生持续感染,是马属动物最重要的传染病之一。
我国研制成功的马传染性贫血驴白细胞弱毒(equineinfectiousanemiavirusdonkeyleukocyteattenuated,EIAVDLA)疫苗成功控制了马传染性贫血病在我国的流行。该疫苗具有良好的安全性和有效性,成为研究包括人艾滋病病毒在内的慢病毒疫苗的良好自然动物模型。EIAV弱毒疫苗研制成功的路线是:将一株来源于马体的EIAV强毒(辽毒株、EIAVL)经过驴体连续传代100余代使病毒毒力增强后获得了驴强毒株(EIAVD,对马和驴90%致死率),然后将驴强毒株通过驴白细胞体外连续培养驯化120代,使病毒毒力丧失的同时保持了良好的免疫原性,最终培育成功了EIAV驴白细胞弱毒疫苗(EIAVEDLA)。将驴白细胞弱毒疫苗进一步通过驴胎皮肤细胞继代,又获得比驴细胞弱毒疫苗免疫保护效果更好的驴胎皮肤细胞(fetaldonkeydermalcells,FDD)弱毒疫苗。
为了揭示我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱及免疫保护的分子机制,为人免疫缺陷病毒及其它慢病毒的免疫预防提供借鉴,对我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗传代过程中的三个经典毒株(强毒株EIAVL、疫苗株EIAVDLV和EIAVFDDV)共34个env基因gp90进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,强弱毒gp90序列存在着多个位点高度的一致性变异,所推导的氨基酸也存在19个位点极其一致性变异,这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失,其中,氨基酸在极性与非极性之间的变换及氨基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。经过分析发现,在gp90基因的V3到V5区中,EIAV强毒存在3处N-连接糖基化位点,它们是g5、g9、g10,弱毒对应区域不存在这3处N-连接糖基化位点。
对以HIV为主的慢病毒研究表明env基因中N-连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中和作用密切相关。我国马传染性贫血病毒强弱毒env基因之间N-连接糖基化存在明显的区别;根据强弱毒env基因变异的分析结果,以疫苗株全长感染性克隆pLGFD3-8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行了糖基化序列回复操作,构建了七组全基因感染性克隆pLGFDg5、pLGFDg9、pLGFDg10、pLGFDg5g9、pLGFDg5g10、pLGFDg9g10、pLGFDg5g9g10。将该七组突变克隆体外分别转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以FDD细胞及驴白细胞(DL)传代,通过逆转录酶活性试验、间接免疫荧光及RT-PCR等方法验证其转染结果。结果显示,七组突变克隆衍生病毒感染FDD和DL细胞均出现明显的细胞病变,电镜下可见大量典型的EIAV颗粒,将其衍生病毒分别命名为VpLGFDg5、VpLGFDg9、VpLGFDg10、VpLGFDg5g9、VpLGFDg5g10、VpLGFDg9g10、VpLGFDg5g9g10。细胞培养上清可检测到RT酶活性;间接免疫荧光检测呈阳性、用RT-PCR检测剑EIAV保守基因片段。并在细胞水平上对该七组突变克隆衍生毒及其亲本感染性分子克隆毒株复制能力进行了检测,发现与其亲本克隆衍生病毒相比,大部分突变克隆衍生病毒在FDD、DL两种细胞类型上均表现出不同程度延缓的生长动力学,推测可能是由于亲本vpLGFD3本身就是细胞适应株,在体外细胞培养中,能够很好的复制。而突变克隆衍生的病毒携带部分强毒特征,在体外细胞上缺乏足够的适应性。又由于g5、g9、g10位于EIAV的主要中和区(PND)及PND的下游,因此本研究对该七组突变克隆衍生毒及其亲本感染性分子克隆毒的中和敏感性进行了检测。结果表明:不同突变克隆衍生的病毒对中和抗体的敏感性也不同。g5、g9突变克隆降低了其衍生病毒vptGFDg5、VpLGFDg9对中和抗体的敏感性,表明位于中和区的这些糖链可以掩盖潜在的中和表位,使病毒能部分逃逸中和抗体的识别;而g10突变克隆对其衍生病毒vpLGFDg10对中和抗体的敏感性影响不大。说明N-糖链的位置不同,其生物学特性也不同。