论文部分内容阅读
目的:1.研究白藜芦醇治疗肠癌的机制是否与铁死亡有关。2.研究白藜芦醇抑制结肠癌是否与miR-31有关。方法:在体实验:AOM+DSS诱导小鼠肠癌模型。28只雄性C57BL/6小鼠,适应性饲喂一周,期间小鼠进食普通饲料。第二周开始造模,小鼠随机划分成四组（n=7）,Control组、AOM组、AOM+DSS组和AOM+DSS+Res组,造模周期为70天。造模开始后每组喂食高铁饲料。造模第一天,AOM组、AOM+DSS组和AOM+DSS+Res组腹腔注射浓度为10mg/kg的AOM,第一周各组均饮用灭菌水。第二周AOM+DSS组和AOM+DSS+Res组饮用含1%葡聚糖硫酸钠盐（DSS）水,其余两组仍饮用灭菌纯净水。第三周AOM+DSS组和AOM+DSS+Res组饮用灭菌水,第四周饮用含1%DSS水,以此类推直到造模结束。其他组整个造模周期饮用灭菌水。从造模第一周开始,AOM+DSS+Res组给予0.1mL 10mg/mL白藜芦醇灌胃,诱导肠癌模型期间每天灌胃白藜芦醇。造模结束后,处死小鼠,取小鼠结肠标本固定,苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠结肠组织学与病理结构;qRT-PCR检测小鼠结肠组织ACSL4、FTH、GPX4、SLC7A11基因的表达;免疫组织化学检测小鼠结肠组织中ACSL4、FTH、GPX4、xCT、P53蛋白表达水平;Western Blot检测小鼠结肠组织ACSL4、FTH、GPX4、xCT、P53蛋白表达水平。体外实验:白藜芦醇诱导HCT 116细胞铁死亡,将HCT 116细胞分为Control/R4/R8/R16四个白藜芦醇浓度梯度组,加药48h后,CCK-8检测细胞增殖活性;检测细胞内Fe含量、MDA含量、SOD含量和GSH含量。Western blot检测ACSL4、FTH、GPX4、xCT的表达水平。miR-31敲低和过表达实验:将HCT 116细胞分为Control组、miR-31 inhibitor组、miR-31 inhibitor+Res组、miR-31 mimic组、miR-31 mimic+Res组,miR-31 inhibitor和miR-31 inhibitor+Res组转染miR-31 inhibitor,miR-31 mimic组和miR-31mimic+Res组瞬时转染miR-31 mimic。miR-31 inhibitor+Res组和miR-31 mimic+Res组,转染24小时后加入白藜芦醇作用,miR-31 inhibitor组和miR-31 mimic组加入等量的DMSO。给药后48h收集细胞,Western Blot检测ACSL4、FTH、GPX4、xCT蛋白的表达。结果:1.小鼠结肠组织HE染色结果显示,Control组肠壁薄,厚度均匀,上皮结构正常,隐窝结构正常,腺体排列整齐,无病变。AOM组可见黏膜层有炎细胞浸润,腺体结构破坏,隐窝结构不完整,但腺体排列规则,无异型性。AOM+DSS组肠壁明显增厚,隐窝破坏严重,癌细胞排列紊乱,中央可见空泡,AOM+DSS+Res组与AOM+DSS组相比,肠壁变薄,腺体排列较规则,黏膜和上皮损伤情况减轻。2.Western Blot检测小鼠结肠组织xCT、GPX4、ACSL4、FT、P53蛋白表达情况,与Control组相比,AOM组FTH蛋白（P＜0.05）、GPX4（P＜0.05）表达减少,ACSL4蛋白表达明显上升（P＜0.01）,P53和xCT蛋白表达无明显差异。AOM+DSS组xCT（P＜0.0001）、FTH（P＜0.05）、GPX4（P＜0.01）蛋白表达上升,P53（P＜0.01）、ACSL4（P＜0.05）蛋白表达量下降。与AOM+DSS组相比,AOM+DSS+Res组xCT（P＜0.05）、GPX4（P＜0.01）、FTH（P＜0.05）蛋白表达下降,P53（P＜0.05）、ACSL4（P＜0.001）蛋白表达量上升。3.IHC检测小鼠结肠组织xCT、GPX4、ACSL4、FTH、P53蛋白表达情况,与Control组相比,AOM组小鼠结肠组织FTH蛋白表达降低（P＜0.01）,xCT、GPX4、ACSL4、P53表达无统计学差异。AOM+DSS组xCT（P＜0.01）、FTH（P＜0.001）、GPX4（P＜0.05）蛋白表达上升,P53（P＜0.0001）、ACSL4（P＜0.0001）蛋白表达量下降。与AOM+DSS组相比,AOM+DSS+Res组xCT（P＜0.01）、GPX4（P＜0.05）、FTH（P＜0.05）蛋白表达下降,P53（P＜0.01）、ACSL4（P＜0.001）蛋白表达量上升。4.qRT-PCR测定了小鼠结肠组织铁死亡有关基因的表达水平,扩增结果表明,与Control组比较,AOM组的ACSL4（P＜0.01）基因表达上升,GPX4（P＜0.01）基因表达下降,SLC7A11和FTH表达无统计学差异（P＞0.05）。AOM+DSS组ACSL4基因表达下降（P＜0.01）,GPX4（P＜0.01）和SLC7A11（P＜0.01）表达上升、FTH（P＜0.0001）基因表达明显上升。与AOM+DSS组相比,AOM+DSS+Res组ACSL4基因表达上升（P＜0.05）,GPX4、SLC7A11、FTH基因表达下降（P＜0.05＆P＜0.05＆P＜0.05）。5.白藜芦醇可以抑制HCT 116细胞增殖活性。CCK-8检测HCT 116细胞增殖活性结果显示,与对照组相比,白藜芦醇作用于HCT 116细胞后可显著抑制HCT116细胞增殖（P＜0.05）。6.检测细胞内MDA、SOD、GSH和Fe,结果显示,与Control组相比,白藜芦醇作用可以增加细胞内MDA（P＜0.01）和Fe（P＜0.05）含量,降低SOD（P＜0.05）和GSH（P＜0.05）含量,说明白藜芦醇可以通过增加细胞内Fe含量和脂质过氧化,降低细胞内抗氧化物质促进铁死亡。7.Western Blot检测细胞蛋白水平的改变结果显示,与Control组相比,给予白藜芦醇后,HCT 116细胞内ACSL4（P＜0.01）蛋白表达上升,GPX4（P＜0.05）、FTH（P＜0.01）、xCT（P＜0.05）蛋白表达下降。而且作用有剂量依赖性。说明白藜芦醇可以调节铁死亡通路关键蛋白的表达促进铁死亡。8.miR-31敲低和过表达实验,实验结果显示,miR-31 mimic组ACSL4（P＜0.001）蛋白表达下降,GPX4（P＜0.05）、xCT（P＜0.05）、FTH（P＜0.05）的蛋白质表达显著增加。miR-31 inhibitor组ACSL4（P＜0.001）蛋白表达上升,GPX4（P＜0.01）、xCT（P＜0.001）、FTH（P＜0.0001）蛋白表达下降。给予白藜芦醇后,与miR-31 mimic组比较,miR-31 mimic+Res组ACSL4（P＜0.05）表达上升,GPX4（P＜0.01）、xCT（P＜0.01）、FTH（P＜0.05）蛋白表达明显减少。与miR-31 inhibitor组相比,miR-31inhibitor+Res组ACSL4蛋白表达升高（P＜0.05）,GPX4、xCT、FTH蛋白表达降低（P＜0.05）。实验说明白藜芦醇抑制铁死亡与miR-31有关。结论:白藜芦醇能够抑制AOM+DSS诱导的小鼠结肠癌,作用机制与促进铁死亡发生有关,白藜芦醇通过下调miR-31表达促进铁死亡。