天然产物具有多种生物活性,如抗细菌,抗病毒,抗肿瘤等作用,一直是药物研发的重要来源。同时,天然产物中的色素类化合物因易于降解和环境友好等特点,可以作为生物染料替代化学染料使用。近年来由于抗生素的大量使用,导致多种临床耐药菌的产生。由于新抗菌药物的严重缺乏,使得人类对新药的需求迫在眉睫,而依赖于传统手段的天然产物发掘遇到瓶颈,发现新化合物的几率越来越小。链霉菌是一种革兰氏阳性菌,可以产生多种具有应用价值的次级代谢产物,如抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂和生物染料等。链霉菌基因组的大小约为8～10 Mb,一般含有多个与次级代谢产物合成相关的基因簇,如PKS、NRPS等。但是,通常情况下基因组的（部分）基因簇可能处于沉默状态,不能生成最终产物。异源表达是激活沉默基因簇的一种有效的方法。为了发掘新的天然产物,在本研究中我们首先构建了十株放线菌的细菌人工染色体（BAC）文库,选取既不产生色素也无抑菌活性的Streptomyces noboriitoensis-24（Snt 24）的BAC文库进行高通量接合转移和异源表达。通过表型筛选（观察是否产生色素）与功能筛选（是否具有生物活性）,我们筛选到多个只能在异源宿主中产生红色色素和活性物质的阳性克隆,说明在新的宿主中沉默基因得到表达。通过对发酵产物的分离纯化,我们鉴定了两种红色色素组分的化学结构,并对活性物质进行了初步的分离纯化。Ⅰ:细菌人工染色体文库的构建通常情况下,克隆特定生物合成基因簇的基础是构建一个基因组文库,然后利用PCR或Southern杂交等从文库中钓取阳性克隆。对于一个特定的细菌基因组来说,文库克隆所容纳的外源片段越小,需要的文库克隆数就越多,后期筛选工作量就越大;反之,如果所容纳的外源片段越大,则需要的克隆数就越少,筛选工作量越小。Cosmid是构建基因组文库的常用载体,可以容纳35～45 kb的DNA片段。但是,由于cosmid会导致外源DNA的高拷贝复制,易造成外源DNA的缺失。另外一些已知的次级代谢产物的基因簇通常超过cosmid的容量,因此在cosmid文库中往往克隆不到完整的次级代谢产物的生物合成基因簇。BAC载体可以容纳的DNA外源片段达到300 kb以上,而且由于BAC在大肠杆菌体内是单拷贝,因此比cosmid更稳定。目前,构建一个用于筛选和异源表达的高质量基因组文库（随机外源片段超过100kb）仍然是一个很大的挑战。由于很多次级代谢生物合成基因簇往往超过50 kb,如果克隆的DNA片段小于50 kb,则很难得到完整的基因簇,这也是限制新天然产物发现的一个重要原因。因此以BAC为载体,构建一个大容量的基因组文库是一个很好的选择。我们首先进行了 BAC文库的构建,本研究一共构建了10个高质量的放线菌BAC文库,包括8个链霉菌的BAC文库、1个刺糖多胞菌的BAC文库和1个诺卡氏菌的BAC文库。Ⅱ:Snt24 BAC文库的筛选Snt 24是从神农架原始森林土壤中分离的一株链霉菌,通过16s rDNA的序列分析,我们推测Snt 24可能是一株新的链霉菌。Snt 24在多种培养基（MS培养基、R3培养基、YBP培养基、GYM培养基、YPD培养基和18#培养基）中均不产生任何色素类化合物,而且也没有明显的生物活性（以大肠杆菌DH10B、金黄色葡萄球菌、蕈状芽孢杆菌、耻垢分支杆菌和清酒酵母为指示菌）,提示Snt 24的（部分）次级代谢途径可能处于沉默状态。Snt 24的BAC文库包含600个克隆,平均克隆片段约108 kb,阳性克隆率为87%,至少覆盖基因组5倍。通过对Snt 24 BAC文库克隆的高通量异源表达,结合表型观察和功能筛选,我们筛选到6个具有抑菌（金黄色葡萄球菌和蕈状芽孢杆菌）活性的BAC克隆。有趣的是,带有这6个克隆的接合转移子不仅能产生活性物质,同时还能产生一种红色色素。6个BAC克隆的PvuⅡ酶切图谱及末端测序分析表明,这6个BAC克隆互相重叠。另外,我们还得到1个可以产生黑色素的BAC克隆,并进行了初步分析。Ⅲ:杂红素的分离鉴定及其合成途径的研究通过对SBT18/6D1发酵,利用多种开放柱分离发酵提取物,结合HPLC检测分析,我们纯化得到2 mg化合物A,0.5 mg化合物B和1 mg化合物C,分别命名为杂红素A、杂红素B和杂红素C。精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪（Q-TOF）分析表明杂红素C的分子量为285.0831,杂红素A的分子量为297.1191,杂红素B的分子量为297.1190,提示杂红素A和B是同分异构体。通过对核磁数据的分析,我们解析了杂红素A和杂红素C的结构。杂红素类化合物由一个双吡咯环和一个特窗酸组成,杂红素A与杂红素C的区别在于:杂红素A特窗酸5位碳上含有一个烯丙基,而杂红素C特窗酸5位碳上是一个羰基。由于杂红素B的量较少,不足以进行碳谱分析,目前还不能确定其化学结构。我们对可以产生红色色素及活性物质的BAC克隆6D1进行了全测序。序列分析表明6D1中含有一个约40 kb的NRPS类基因簇,与其它已知NRPS基因的同源性较低。基于杂红素的结构,我们推测杂红素类化合物的合成可能是由异源宿主SBT5与6D1克隆中的NRPS基因簇共同完成的,SBT5中的Red合成途径可能负责双吡咯环的合成,而6D1中的NRPS基因簇可能参与了特窗酸的合成。为了验证杂红素的合成与NRPS基因簇相关,我们在6D1的基础上构建了pHZZL1、pHZZL2、pHZZL3和pHZZL4。pHZZL1 包含整个 NRPS基因簇,为60399 bp;pHZZL2包含NRPS中从U到R1之间共16个基因,为34694 bp;pHZZL3包含NRPS中从U到H之间共10个基因,为26668 bp;而pHZZL4包含NRPS中的U基因、A基因和部分B基因,为22391 bp。分别将pHZZL1-4转移到宿主 SBT18 中。SBT1 8/pHZZL1、SBT18/pHZZL2、SBT1 8/pHZZL3 和SBT1 8/pHZZL4 与 SBT18/6D1 的代谢谱的分析表明,SBT18/pHZZL1、SBT18/pHZZL2、SBT18/pHZZL3 和 SBT18/6D1 均能产生杂红素 A、杂红素 B 和杂红素C,而SBT1 8/pHZZL4则失去了产生红色化合物的能力,说明（1）杂红素类化合物与6D1的NRPS生物合成基因簇有关,（2）从hrnB到hrnH之间的基因对杂红素的合成是必须的。为了验证SBT5中的Red途径也参与了杂红素的合成,我们检测了 pHZZL3在敲除了 redMN的S.lividans XF2（SBT5△redMN）中的表达情况。HPLC分析表明XF2/pHZZL3不能产生杂红素A-C,表明杂红素类化合物的合成与十一烷基灵菌红素中的MBC途径有关。我们在pHZZL3质粒的基础上对hrnU到hrnH之间的基因进行了敲除,初步确定了参与杂红素合成的基因。根据基因敲除实验和每个基因的预测功能,推测了杂红素的生物合成途径。Ⅳ:活性化合物的分离6D1等6个BAC克隆的接合转移子不仅能产生红色色素,而且能产生（一种）活性物质,可抑制金黄色葡萄球菌和蕈状芽孢杆菌的生长。PvuⅡ酶切图谱分析表明,6个BAC克隆的重叠区域大约50 kb。在重叠区域中含有一个约35 kb的NRPS基因簇。NRPS基因簇中含有两个调控基因R1（TetR）和R2（SARP）,调控基因R1敲除后抑菌活性有一定程度的增加,说明R1是一个负调控基因。与其它宿主相比,以M1 154为宿主时活性物质的抑菌活性最强,与红色色素不同（红色色素最适宜的宿主为SBT18）。因此,为了排除6D1中其它基因对活性化合物合成的影响,我们构建了包含完整NRPS基因簇的质粒pHZZL5,转入M1 154/6728,进行发酵。利用多种开放柱结合生物活分析对活性物质进行分离和追踪。我们发现正相柱分离后的样品虽然具有生物活性,但是没有明显的紫外吸收。Q-TOF分析表明正相柱分离样品中含有大量分子量为342的化合物,因此我们推测活性化合物可能没有紫外吸收或紫外吸收极弱。目前我们正在尝试运用LC-MS检测与活性追踪的方纯化活性化合物。