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研究背景肺表面活性蛋白B(SP-B)是由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种疏水蛋白,在降低肺泡表面张力和宿主防御方面起着重要的作用。SP-B在肺表面活性物质功能中起重要作用,而且与肺部疾病相关。SP-B缺乏的小鼠在出生时死于严重急性呼吸衰竭。人SP-B基因有数个多态性基因位点,其中重要的单核苷酸多态性(SNP rs1130866,即SP-B 1580 C/T),该多态性形成两种常见的遗传等位基因,SP-B C和T等位基因,C等位基因有额外的N-连接糖基化位点而T等位基因没有,这种糖基化位点的不同可能影响SP-B蛋白在某些疾病或压力状态下的加工和功能,该多态性具有不同的维持呼吸稳态能力和宿主防御功能。研究表明SP-B 1580C/T基因多态性与肺部疾病有关。SP-B基因1580位点携带C等位基因的成年以及儿童患者更容易受到严重的肺损伤。铜绿假单胞菌肺炎是一种ICU常见的革兰氏阴性菌感染,可直接引起肺损伤,严重者可引起脓毒症甚至可危及生命,导致死亡率较高。人SP-B基因1580C/T多态性对铜绿假单胞菌肺炎尤其是重症肺炎的易感性研究较少,其相关机制研究更少。转人类基因(hTG)小鼠模型为人类基因多态研究扩展了更多可能性,可研究人类基因复杂的病理生理过程,是人类疾病研究的有利工具。本研究采用hTG SP-B 1580C/T小鼠建立铜绿假单胞菌肺炎模型,研究其不同等位基因的易感性差异并探讨相关机制。研究目的1.建立hTG SP-B 1580C/T小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型,监测小鼠体内细菌变化,在组织学及分子水平上分析组织损伤及炎性水平;2.研究铜绿假单胞菌肺炎hTG小鼠的肺SP-B变化,NF-κB/NLRP3信号通路及细胞死亡;3.研究人SP-B 1580C/T小鼠不同等位基因的易感性差异并探讨相关机制。研究方法一、转人SP-B基因小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的建立及肺损伤的观察1.选取8-12周鼠龄,体重25g左右的转人类SP-B基因小鼠(FVB/N系背景)以及FVB/N野生型WT小鼠,对所有小鼠剪尾提取DNA进行PCR基因鉴定,根据PCR结果将小鼠分为三组SP-B-T组、SP-B-C组、WT组。每组小鼠再随机分为2组:肺炎组(Pneumonia组)以及对照组(Control组)。2.将表达生物荧光的铜绿假单胞菌Xen5菌株进行细菌培养,分光光度法测定菌液的浓度,并接种在琼脂板培养基隔夜培养进行菌落计数以确定菌液浓度。将菌液用无菌生理盐水稀释500倍,肺炎组的小鼠每只经气管内注入50μl稀释的菌液(每只小鼠约4 ×104 CFU),对照组每只小鼠经气管内注入50μl无菌生理盐水。肺炎模型建立后,定期观察小鼠的一般情况,并定期进行体内荧光活体成像,监测铜绿假单胞菌在小鼠体内的生长状况,观察肺炎模型小鼠的生存状况,计算该肺炎模型小鼠的死亡率指标。3.建模24小时后,麻醉处死各组小鼠,留取新鲜血液,肺泡灌洗液(BALF)及新鲜肺组织。取新鲜稀释的BALF液进行琼脂板培养基接种细菌培养,观察BALF中的细菌菌落计数。光学显微镜下计数肺泡灌洗液中的细胞总数,并将BALF甩片经HEMA3染色后观察巨噬细胞和中性粒细胞分类情况。新鲜肺组织经10%福尔马林固定24小时后,进行石蜡包埋切片HE染色,观察肺组织病理变化并进行肺组织损伤评分,以评估肺损伤的严重程度。应用透射电子显微镜观察肺组织在细胞水平的病理变化。4.将肺组织用PBS液充分匀浆,高速离心后,收集上清液并用BCA方法测定总蛋白浓度,Western Blot法测定各组肺组织中SP-B蛋白表达水平。测定BALF中总蛋白浓度,并用Western Blot法测定各组BALF中SP-B蛋白表达水平。免疫荧光法观察各组肺组织SP-B表达水平,并比较各组SP-B的差异。5.将新鲜BALF高速二次离心后提取大聚体(LAs),应用约束液滴表面光度法(constrained drop surfactometry,CDS)测定表面张力。37℃和相对湿度接近100%下,以每秒20循环的速度压缩和膨胀吸附的表面活性剂膜,以模拟正常的潮汐呼吸。采用闭环轴称滴形分析法(closed-loop axisymmetric drop shape analysis,CL-ADSA)同时测定表面活性剂膜的表面张力和表面积。用动态循环期间的最小表面张力(γmin)作为表面活性的指标。二、人SP-B基因1580C/T多态性对肺炎模型的易感性差异及潜在机制6.用免疫荧光法及Western Blot法观察肺组织pNF-κB的表达,同时应用ELISA方法测定血清、肺组织匀浆液及BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平,比较该模型下各组小鼠炎性水平的差异。7.用TUNEL方法观察各组小鼠肺组织凋亡细胞情况并比较其差异。Western Blot法测定各组肺组织中凋亡相关蛋白Bcl-2,cleaved caspase-3的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞凋亡情况。8.用免疫荧光方法观察各组小鼠肺组织pMLKL表达情况并比较其差异。Western Blot法测定各组肺组织中坏死性凋亡相关蛋白RIP3,MLKL,pMLKL的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞坏死性凋亡情况。9.用免疫荧光方法观察各组小鼠肺组织NLRP3表达情况并比较其差异。Western Blot 法测定各组肺组织中NLRP3,ASC,cleaved caspase-1,GSDMD的表达水平并比较各组间的差异,以观察该模型中细胞焦亡情况。10.统计学方法:结果以平均值±SEM的形式表示。本研究采用SigmaStat统计学软件进行统计学处理,并应用GraphPad Prism绘图软件进行作图。数据经检验符合正态分布,两组之间采用独立样本Student’s t检验,三组小鼠之间的比较是通过单因素方差分析进行分析。生存率的比较使用Kaplan-Meier生存曲线并通过Log-rank检验进行统计学分析。当P<0.05时,考虑各组之间有统计学差异,当P<0.01时认为统计学差异非常显著。结果一、转人SP-B基因小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的建立及肺损伤的观察1.PCR基因分型鉴定结果显示hTG小鼠表达人SP-B C或T等位基因,但不表达小鼠SP-B基因,WT小鼠仅表达mSP-B基因。Western Blot和免疫荧光观察正常hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠的肺组织中SP-B的表达,结果显示,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠的肺中均正常表达SP-B。此外,Western半定量分析表明,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠肺中的SP-B水平相当。2.建模后三种小鼠对照组精神状态好,饮食及活动正常;而肺炎组小鼠精神萎靡不佳,饮食量明显减少,行动迟缓。IVIS-200活体成像系统动态监测小鼠体内细菌荧光成像,结果显示感染后小鼠体内大量细菌生长。感染12小时后三种类型小鼠体内细菌都急剧增加;与SP-B-T和WT小鼠相比,SP-B-C小鼠的细菌负荷水平在感染后24、36和48小时都最高。感染后SP-B-C小鼠48小时的死亡率高于SP-B-T和WT小鼠,对照组小鼠均没有死亡,表明三种类型的小鼠对该铜绿假单菌肺炎存在敏感性差异。3.感染24小时后,感染小鼠与对照组相比BALF中的总细胞数显着增加,且SP-B-C小鼠的总细胞数在三类感染小鼠中最高。显微镜下观察到对照组的BALF中仅有巨噬细胞,而感染小鼠的BALF中90%以上的细胞是嗜中性粒细胞。感染后BALF中巨噬细胞较对照组增加,三种小鼠间巨噬细胞无差异。感染后BALF嗜中性粒细胞较对照组增加,三种小鼠中SP-B-C小鼠嗜中性粒细胞数目最高。感染小鼠的BALF有大量细菌生长,而对照组小鼠BALF未培养出细菌,肺炎感染组SP-B-C小鼠肺中细菌CFU数在三种小鼠中最高。4.肺组织切片HE染色显示,与对照组相比,感染小鼠出现明显的肺损伤,肺泡内及肺间质中可见大量炎性细胞聚集,并可见大量蛋白质碎片堆积,以及肺泡壁增厚。肺损伤评分显示三种类型感染小鼠的评分均显著高于各个对照组,感染SP-B-C小鼠的损伤评分高于感染SP-B-T及WT小鼠。5.透射电子显微镜观察到各对照组小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞内有许多正常的板层小体以及线粒体结构,而感染后的小鼠在电镜下可观察到自噬小体数目增加,板层小体结构受损,线粒体异常,以及Ⅱ型肺泡细胞中微绒毛数量减少。6.免疫荧光结果显示,感染后SP-B表达下降,每个高倍镜视野下SP-B表达阳性的细胞数SP-B-C小鼠明显低于SP-B-T和WT小鼠。Western Blot结果显示,三种小鼠的肺组织以及BALF中SP-B表达也显示出相似的趋势。Western半定量分析表明,各种类小鼠之间肺组织和BALF中SP-B表达的存在显着差异,三种类型的感染小鼠中SP-B-C小鼠的SP-B表达最低。7.小鼠BALF中肺表面活性物质(主要指大聚体LAs)表面张力测定结果显示,与对照组小鼠相比,肺炎组小鼠的最小表面张力(γmin)显著增高,提示感染后小鼠肺表面活性功能明显受损。三类小鼠的对照组的γmin无差别,而肺炎组的γmin有显著差异,SP-B-C>SP-B-T>WT,表明在感染条件下,hSP-B基因多态对肺泡表面张力的调节存在差异。二、人SP-B 1580C/T基因多态性对肺炎模型的易感性差异及潜在机制8.应用免疫荧光和Western Blot分析方法检查了肺组织中NF-κB炎性信号通路中活化的pNF-κB蛋白的表达。免疫荧光显示,对照组小鼠无pNF-κB蛋白的表达,肺炎组小鼠pNF-κB表达显著增高。pNF-κB表达阳性的细胞数统计分析显示,hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠肺炎组pNF-κB表达均比对照组明显升高,有统计学差异,与受感染的SP-B-T及WT小鼠相比,感染的SP-B-C小鼠的pNF-κB蛋白水平最高。Western Blot结果显示同样的趋势,感染后hTG SP-B-C/T小鼠和WT小鼠pNF-κB表达显著增高,与受感染的SP-B-T及WT小鼠相比,感染的SP-B-C小鼠的pNF-κB/NF-κB 比例最高,差别有统计学意义。9.ELISA方法测定结果显示,感染后三种小鼠的血清、肺组织匀浆液及BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平均较对照组显著增高,感染后SP-B-C小鼠细胞因子水平明显高于感染后的SP-B-T及WT小鼠,有显著性差异。10.用TUNEL方法分析感染小鼠肺细胞凋亡情况,感染24小时后,三种类型小鼠均可见大量的凋亡细胞,而对照组小鼠则未见凋亡细胞。TUNEL 阳性细胞的定量分析表明,感染的SP-B-C小鼠的凋亡细胞数量显著高于感染的SP-B-T和WT小鼠。Western Blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内Bcl-2水平低于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的Bcl-2水平低于SP-B-T和WT小鼠。感染后三种类型小鼠肺内cleaved caspase-3水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的cleaved caspase-3水平高于SP-B-T和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生细胞凋亡,且SP-B-C小鼠的凋亡更严重。11.免疫荧光显示感染小鼠的肺内pMLKL高表达,而对照组小鼠中未见表达,提示存在细胞坏死性凋亡。pMLKL阳性细胞的定量分析显示,肺炎组SP-B-C 小鼠中pMLKL阳性细胞数量明显高于SP-B-T和WT小鼠。Western blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内RIP3水平低于对照组,SP-B-C小鼠的RIP3水平低于WT小鼠。感染后MLKL和pMLKL的表达增加,SP-B-C小鼠的MLKL和pMLKL水平高于SP-B-T和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生坏死性凋亡,且SP-B-C小鼠的坏死性凋亡更严重。12.应用免疫荧光和Western Blot分析方法检查了肺组织中NLRP3和焦亡相关蛋白的表达。免疫荧光显示感染小鼠的肺内NLRP3大量激活,而对照组小鼠中未见激活。NLRP3阳性细胞的定量分析显示,感染的SP-B-C小鼠中NLRP3阳性细胞数量显著高于感染的SP-B-T和WT小鼠,而SP-B-T小鼠高于WT小鼠。Western blot结果显示,感染后三种类型小鼠肺内NLRP3水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的NLRP3水平高于SP-B-T和WT小鼠。感染后ASC和cleaved caspase-1的表达增加,SP-B-C小鼠的水平高于SP-B-T小鼠。三种类型的小鼠中,肺炎组小鼠的肺内GSDMD水平高于对照组小鼠,SP-B-C小鼠的GSDMD水平高于SP-B-T小鼠和WT小鼠。这些结果表明铜绿假单胞菌感染后小鼠肺内发生焦亡,且SP-B-C小鼠的焦亡更严重。结论在铜绿假单胞菌肺炎模型中,感染后转人基因SP-B 1580C/T小鼠体内细菌大量生长,出现严重的肺损伤,大量炎性细胞及高死亡率,肺内SP-B蛋白水平明显降低,肺表面活性物质表面张力明显升高,小鼠体内NF-κB及NLRP3信号通路激活,炎性细胞因子水平增加,出现细胞凋亡,坏死性凋亡和焦亡等细胞死亡类型,SP-B-C小鼠较SP-B-T小鼠表现出更高的易感性,炎性损伤更重,更多的细胞死亡。提示SP-B 1580C/T多态可通过调节NF-κB及NLRP3通路及细胞死亡发挥对肺炎致ARDS的易感性调控作用。