鸡大肠杆菌病是由某些毒力血清型大肠埃希菌引起的，血清型复杂，疫苗预防效果较差，是危害我国畜牧业的重大疾病。恩诺沙星具有抗菌谱广、吸收迅速、分布广泛、生物利用度高、毒副作用小等特点而常用于细菌病的防治。由于临床上药物的大量应用导致其耐药性增加，疗效降低。PK-PD能够同时考虑机体、菌株、抗生素三者的相互关系，用于给药方案的制定。本课题采用临床致病菌，研究药动学(PK)以及体外和半体内药效学(PD)，使用Winnonlin分析恩诺沙星对大肠埃希菌的药动药效模型，制定出恩诺沙星治疗鸡大肠杆菌病的给药方案，同时减少耐药性的产生。　　1、临床鸡源大肠埃希菌的采集和菌株的筛选　　对华中五省进行1000株临床鸡大肠埃希菌的采集，分离得到菌株929株，分离率高达92.9％。测定恩诺沙星和代谢物环丙沙星对分离菌的最小抑菌浓度(MIC)，利用统计学软件SPSS对MIC进行分析，得MIC50和MIC90分别为0.5μg/mL和16μg/mL。选取MIC50附近的98株菌进行血清型鉴定，对同时鉴定出O和K血清型的13菌株进行小鼠的致病性试验。结果安徽112在高中剂量死亡率达100％毒力较强，故选择该菌株用于药效学研究和疾病模型的构建。　　2、恩诺沙星在鸡体内的药物代谢动力学研究　　选用160羽科宝肉鸡分为二组，一组攻毒，构建大肠埃希菌腹泻模型，另一组为健康模型。按10mg/kg体重灌胃给药后在0、0.25h、0.5h、0.75h、1h,1.5h,2h,3h、4h、8h、12h、24h、48h各时间点取6只鸡的血液和肠内容物，使用HPLC检测。结果表明:恩诺沙星以其代谢物环丙沙星在健康模型血浆中浓度之和最高为1.83μg/mL，由于血浆中浓度较低，本课题选择浓度较高的肠道来进行模型拟合。健康鸡各时间点肠道中两者浓度和分别为:10.16、16.49、21.56、28.54,16.99,15.17,20.71、19.64、11.67、5.33、1.64、0.41μg/mL，患病鸡各时间点肠道中两者浓度之和分别为:23.42、24.91、29.44、28.61、34.05、31.91、30.12、22.70、21.49、12.71,4.82、0.51μg/mL。药动参数使用Winnonlin软件模拟，符合一室有吸收模型。恩诺沙星在鸡肠内容物中Cmax为28.54～34.05μg/mL;Tmax为1.12～1.23h; T1/2为0.62～0.67h;AUC为228.97～444.85h·μg/mL。将健康和患病药动学参数对比可知，AUC与Cmax在健康和患病鸡中差异显著，Tmax在健康和患病模型中的差异不显著，原因可能是感染大肠埃希菌后肠道菌群影响了药物的代谢或者改变了药物作用机制有关酶的活性。　　3、恩诺沙星对鸡大肠埃希菌的药效学研究　　依据CLSI(2009)的M07-A9号文件使用微量肉汤稀释法测定恩诺沙星及代谢物环丙沙星在肉汤和肠道中对大肠埃希菌的MIC和MBC，结果恩诺沙星在肉汤和肠道中的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均分别为0.25μg/mL和0.5μg/mL，环丙沙星在肉汤中和肠道中的MIC均为0.125μg/mL。表明环丙沙星有较强的抗菌活性，且恩诺沙星在肠内容和MH肉汤中对大肠埃希菌的杀菌活性基本一致。用棋盘法测定恩诺沙星和环丙沙星的联合药敏试验，其FIC=0.125/0.25+0.0625/0.125=1为相加作用。使用去除药物的方法测定恩诺沙星对大肠埃希菌的抗生素后效应(PAE)，结果恩诺沙星对大肠埃希菌的PAE表现出浓度依赖性。采用平皿涂布法测定恩诺沙星对大肠埃希菌的最小防突变浓度(MPC)为7μg/mL。根据MIC值，配制恩诺沙星浓度为1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC肉汤绘制体外抑菌曲线。结果表明恩诺沙星为典型的浓度依赖型，随着恩诺沙星浓度的加大，抑菌能力增强，时间缩短。用无菌滤膜将药动实验各时间点的肠道内容物除菌后，接种大肠埃希菌培养，在0、1、2、4、8、12、24h采用涂板法计数，通过每个点的细菌数目得半体内抑菌曲线。结果证明恩诺沙星在半体内环境中同样表现出浓度依赖性的特征，根据药物浓度的不同分别在4h和6h彻底的杀灭细菌，与体外抑菌曲线基本一致。　　4耐药风险评估　　用MH肉汤将恩诺沙星配制为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg/mL的浓度，接种高浓度的细菌后培养。不同时间点取菌液在含恩诺沙星1μg/mL的平皿内进行菌落数目的统计，菌落数目小于100为自然环境导致变异，大于100时为药物作用导致的变异。结果显示，在8μg/mL MPC(7μg/mL)以上浓度培养无耐药菌产生;在2～4μg/mL浓度培养36h后出现耐药菌;在0.25μg/mL和1μg/mL最易产生耐药菌株;低浓度组0.125μg/mL与空白对照组的耐药菌生长基本一致都在24h出现。综上所述，由于在24h会出现耐药菌生长，所以选择给药间隔为24h。　　5 PK-PD模型的拟合与给药方案的制定　　由恩诺沙星抑菌曲线可知恩诺沙星为浓度依赖型药物，选择AUC/MIC和Cmax/MIC为拟合参数。通过Winnonlin分别拟合了AUC/MIC和Cmax/MIC与药效学的关系。发现两个参数模拟得到的剂量基本相同。根据文献调研AUC/MIC参数使用较多，故本课题最终选择AUC/MIC来进行模型拟合。健康模型当E为0时表示抑菌、-3为杀菌、-4为根除，其对应的AUC/MIC依次为258.73、451.35、567.39。患康模型当E为0时表示抑菌、-3为杀菌、-4为根除，其对应的AUC/MIC依次为624.94、1065.93、1343.81。依据剂量计算公式X=d×AUCex vivo/MICtested/AUCin vivo/MICtarget，当临床菌MIC50=0.503μg/mL，E=0、-3、-4时，疾病模型对应给药剂量为7.0、11.9、15.1 mg/kg/d。即大肠杆菌病的预防按7.0mg/kg bw给药;治疗用药按11.9mg/kg bw给药;15.1 mg/kgbw给药时可彻底根除细菌。　　由于畜禽大规模养殖，群体给药公式为D=d×n/W，d为按体重给药量;W为鸡的体重和采食量的转换比，n表示每天给药次数，21日龄的小鸡对于W值约为120g/kg/d，n为1。可知治疗群体给药量为99mg/kg混饲给药，每日一次。　　6模型验证　　为了验证所得给药剂量的临床疗效，选24只健康肉鸡，人工诱发大肠杆菌病后随机分为两组。一组为实验组发病后，按照11.9mg/kg体重给药，每日一次，连续3天。另一组为对照组，对照组在构建疾病模型后不用药。结果:对照组保护率为8.3％，实验组保护率为83.3％。证明该给药方案有明显的治疗作用，适合于临床治疗。　　综上所述，本课题主要阐明了临床鸡源性大肠埃希菌的采集和临床菌株的药敏实验血清型鉴定以及致病性实验，从而选择出目标致病菌株。并进行恩诺沙星对临床菌的体外和半体内药效研究，比较了恩诺沙星在健康和患病鸡体内的肠道动力学特点。成功建立恩诺沙星对鸡大肠杆菌病的药动学药效学同步模型，并进行耐药风险评估。制定出恩诺沙星防治鸡大肠杆菌病的临床给药方案，同时尽量控制耐药性的产生。