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为研制一种治疗奶牛临床型乳房炎的新型抗菌药物,以阿莫西林(AMX)和盐酸左氧氟沙星(LH)为主药,利用先进的纳米技术,通过伪三元相图筛选并优化处方,制备了复方阿莫西林纳米乳(AMX-LH-NE)。对其稳定性、安全性、抗菌效应、治疗奶牛临床型乳房炎的临床疗效及残留消除规律进行了较为系统的研究。一、AMX-LH-NE的制备及评价1. AMX-LH-NE制剂分析方法的建立为制备AMX-LH-NE,并对其进行质量控制研究,利用高效液相色谱仪,分别建立用于制剂中AMX和LH含量检测的分析方法。结果表明,AMX和LH分别在0.5～50μg·mL-1和5～60μg·mL-1浓度范围内线性关系良好;平均回收率为(99.27±1.26)%和(99.65±1.51)%,相对标准偏差(RSD)为1.27%和1.52%;平均保留时间为(10.22±0.13)min和(7.15±0.13)min;日内精密度RSD为1.56%和1.75%,日间精密度RSD为2.46%和2.62%。本研究建立的高效液相色谱(HPLC)分析方法专属性好,回收率、重复性和精密度高,为AMX-LH-NE的制备及其稳定性考察提供了含量测定方法。2. AMX-LH-NE的制备及其质量评价利用伪三元相图,分别考察表面活性剂、油相、助溶剂等主要因素对纳米乳形成的影响,初步确定空白纳米乳的处方组分;利用建立的HPLC分析方法,考察AMX和LH配伍后的理化性质变化;利用Kirby-Baueer试验,确定AMX和LH的最佳配比,最终优化出AMX-LH-NE的制备处方,并制备出AMX-LH-NE。利用离心法、染色法和稀释法,鉴别其结构类型;利用透射电镜和激光粒度分析仪,研究其形态和粒径分布;利用建立的HPLC方法,考察体系对AMX的增溶作用及制剂的稳定性。结果表明,AMX-LH-NE的优化处方是以冰醋酸为助溶剂,聚氧乙烯蓖麻油-40为表面活性剂,肉豆蔻酸异丙酯为油相,蒸馏水为水相,且其处方质量比为:10.5:31.5:3.5:54.5;AMX和LH之间不存在配伍禁忌;针对奶牛乳房炎病原菌,确定两主药的最佳配比为1:1。依配方制备的AMX-LH-NE为O/W型纳米乳;淡黄色,澄明均一,流动性良好;乳滴呈球形,分布均匀;平均粒径为14.30 nm,多分散系数为0.03,约96%的粒子粒径小于18 nm;AMX原料药在纳米乳体系中的溶解度为15.80 mg·mL-1;制剂稳定性良好,有效期为20个月。本研究制备的AMX-LH-NE质量稳定。3. AMX-LH-NE的安全性评价通过急性毒性试验、皮肤刺激性试验和乳腺上皮细胞毒性试验,对AMX-LH-NE进行体内外安全性评价。结果表明,AMX-LH-NE毒性低,无法测出其半数致死量,小鼠的最大耐受量倍数为426倍;无论是单次给药还是多次给药,AMX-LH-NE对完整皮肤和破损皮肤均无明显刺激性;AMX-LH-NE在10～150μg·mL-1浓度范围内,对乳腺上皮细胞的生长和形态无明显影响,其毒性分级属于0或1级,即对乳腺上皮细胞无毒性作用。本研究制备的AMX-LH-NE安全,无毒,刺激性小,符合临床用药的安全性要求。二、AMX-LH-NE对奶牛临床型乳房炎的药效学研究1. AMX-LH-NE对奶牛乳房炎主要病原菌的体外联合抗菌效应研究通过单药纸片搭桥试验、复合药物纸片试验、联合药敏试验、Kirby-Baueer试验,研究AMX-LH-NE对奶牛乳房炎3种主要病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的体外联合抗菌效应。结果表明,AMX和LH联用时表现为协同抗菌作用,对金黄色葡萄球菌的抗菌活性分别是单用时的4倍和8倍,对无乳链球菌的抗菌活性均是单用时的4倍,对大肠杆菌的抗菌活性均是单用时的8倍;对3种病原菌的部分抑菌浓度指数分别为0.375、0.5和0.25;AMX-LH-NE对3种主要病原菌的抑菌效果与其他各组相比,均差异极显著(P<0.01),提示AMX-LH-NE对奶牛乳房炎主要病原菌有较强的抗菌活性。2. AMX-LH-NE治疗奶牛临床型乳房炎的效果观察对临床型乳房炎奶牛分别乳房灌注高、中、低剂量的AMX-LH-NE进行治疗,并与对照药物青链霉素比较。结果表明,高、中、低3个剂量组的治愈率分别为95.16%、89.66%和42.31%,总有效率分别为100%、93.10%和61.54%;青链霉素组的治愈率为68.52%,总有效率为81.48%。统计分析结果显示,高、中剂量的AMX-LH-NE对泌乳期奶牛临床型乳房炎的治疗效果均显著优于低剂量AMX-LH-NE和青链霉素(P<0.05)。据此推荐其在治疗奶牛临床型乳房炎的临床剂量为中剂量,对于临床症状较重的病例,可以适当提高用药量。三、AMX-LH-NE在乳房炎牛奶中的残留消除试验研究为研究AMX-LH-NE在乳房炎牛奶中的残留消除规律,首先建立AMX-LH-NE在牛奶中的残留监控HPLC方法,然后通过残留消除试验,确定其弃奶期。结果表明,AMX和LH分别在7.5～400 ng·mL-1和40～600 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好;平均回收率为(99.72±1.46)%和(99.65±1.53)%,RSD为1.46%和1.54%;平均保留时间为(11.59±0.21)min和(6.87±0.02)min;日内精密度RSD为1.59%和1.39%,日间精密度RSD为3.17%和3.29%。建立的HPLC方法专属性好,回收率、重复性和精密度高,可为牛奶中AMX-LH-NE的残留监控提供检测方法。AMX-LH-NE在乳房炎牛奶中的残留消除试验结果显示,AMX和LH的残留量均随着休药时间延长而迅速降低;AMX的弃奶期为停药后35.96 h,LH的弃奶期为停药后32.94 h,据此推荐AMX-LH-NE的弃奶期以AMX为准。本研究制备的AMX-LH-NE具有广谱、高效、安全、稳定的优点,是治疗奶牛临床型乳房炎的一种新型纳米级复方抗菌药物。根据AMX-LH-NE的临床疗效及在牛奶中的残留消除规律,推荐其在治疗奶牛临床型乳房炎时的给药方案为:每一患病乳区每次20 mL(以AMX计,为200 mg),每日2次,适当稀释后乳房灌注给药,弃奶期为停药后36 h。