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拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）是分布在太平洋和印度洋地区的河口和沿海水域的蟹类。它也是亚洲、特别是中国东南沿海地区的重要经济养殖蟹类之一。为了满足全国乃至世界各地的消费需求,青蟹在捕捞后被运至内陆出售。从我国东南沿海运输至西北内陆时,运输时长通常超过72 h。为了降低运输费用,增加运输效率,生产实践中采用无水运输。但无水运输法可能导致蟹类失去充足的氧气补给,造成组织功能性缺氧最终导致发病和死亡,造成经济损失。该现象的发生是因为干露胁迫下的青蟹体内氧分压（PO2）降低,二氧化碳分压（PCO2）升高导致内部缺氧,引起氧化应激并造成氧化损伤最终导致细胞凋亡的产生。本文主要以拟穴青蟹为研究物种,通过研究青蟹在干露胁迫下组织形态学、生化水平、亚细胞水平及分子水平的变化,进而探究在该胁迫下细胞凋亡的产生机制。1.干露和再浸润胁迫下拟穴青蟹组织形态及抗氧化应激能力的变化扫描电子显微镜观察发现,在干露胁迫下,鳃整体结构皱缩,鳃小片相互粘连且断裂,鳃表面变得粗糙且产生褶皱。同时,分析了干露-再浸润胁迫下,青蟹抗氧化酶活性的变化。青蟹鳃在干露胁迫下,SOD、GST活性在24 h和48 h显著升高。CAT活性在24 h时显著升高,并在之后降低恢复到正常水平。总抗氧化能力（T-AOC）在48 h时显著升高（P<0.05）,但在其他时间均无显著性变化。在再浸润胁迫下,SOD的活性在干露72h和96h后再浸润时,活性显著升高为1.8倍和2.9倍。GST和CAT的活性在干露胁迫72 h后再浸润时,活性显著升高。肝胰腺在干露胁迫下,SOD和T-AOC均在48 h显著升高,而CAT和GST均无显著性变化。在再浸润胁迫下,SOD活性在干露96 h再浸润时显著升高,GST和CAT的活性在干露胁迫72 h再浸润时显著升高,T-AOC则在干露48 h和72 h再浸润时活性显著性升高。本研究发现,干露胁迫会破坏鳃的组织结构。同时,短时间干露胁迫及长时间干露后再浸润胁迫时会上调青蟹抗氧化酶活性来应对氧化应激,防止细胞遭受氧化损伤。2.拟穴青蟹干露胁迫下鳃组织转录组分析在研究中,采用鳃作为研究对象,进行了转录组测序、差异表达基因（DEGs）分析。通过转录组测序获得Transcripts共计565,051个,平均长度为1000 bp,N50 为 1756 bp;得到 Unigene 195,726 个,总长度为 141,868,154 bp,平均长度为724bp,N50为1,377bp。得到共计为21,349条DEGs序列,其中上调基因为281条,下调基因为21,068条。我们随机挑选了 6个基因,通过荧光定量分析验证了转录组数据的准确性。在KEGG富集分析中发现,总共有26,656条序列富集在KEGG数据库的信号通路中,其中免疫相关通路基因（IMD and Toll pathway,lysosome pathway）及细胞凋亡通路（Apoptosis pathway）相关基因表达显著下调,证明干露胁迫可能会影响青蟹免疫水平并且引发细胞凋亡。本研究首次分析了干露胁迫下拟穴青蟹鳃组织的转录组及形态的变化,为今后蟹类抗干露的分子机制研究提供了理论支持。3.凋亡抑制蛋白IAP克隆及干露胁迫下的应答机制凋亡抑制蛋白是参与调节细胞凋亡的重要蛋白之一。因此我们对凋亡抑制蛋白IAP进行克隆,并分析了其功能及干露胁迫下的应答机制。SpIAP的全长序列为3,351bp,包含长度为1,986bp的开放阅读框（ORF）。SpIAP蛋白序列长662 aa,并包括IAP家族保守结构域RING结构域和BIR结构域。SpIAP在所有检测的组织中均有表达,在肝胰腺组织中呈显著性高表达。干露胁迫下,SpIAP的表达量显著升高;在该基因被干扰沉默,干露胁迫后肝胰腺细胞凋亡率显著升高。这些研究结果证明了SpIAP通过抑制细胞凋亡的产生参与了抗干露的应答机制。4.BAX/Bcl-2在拟穴青蟹干露再浸润胁迫中的应答机制为了研究干露-再浸润胁迫下细胞凋亡的应答机制,在拟穴青蟹中克隆了线粒体凋亡通路中关键的激活/抑制蛋白BAX/Bcl-2。本研究在拟穴青蟹中克隆得到SpBAX和SpBcl-2。SpBAX编码一条278aa氨基酸,包含了 BH1,BH2,BH3和一个TM结构域。SpBcl-2编码一条长为207 aa的氨基酸,包含了 BH1,BH2,BH3,BH4和TM结构域。SpBAX和SpBcl-2在所有检测的组织中均有表达,并在肝胰腺中表达量最高。在HEK293T细胞中过表达SpBAX会导致细胞凋亡的产生,共转染SpBcl-2可抑制由SpBAX所引发的细胞凋亡。SpBAX和SpBcl-2在干露-再浸润胁迫下表达水平均显著上升。在干露胁迫下,肝胰腺中SpBcl-2的表达水平始终高于SpBAX,使BAX/Bcl-2比率保持稳定,防止细胞凋亡的产生;在干露-再浸润胁迫下,SpBAX的表达水平超过SpBcl-2,使BAX/Bcl-2比率显著升高,造成Caspase 3活性升高引发细胞凋亡。通过透射电子显微镜观察发现,干露胁迫48 h和96 h后进行再浸润时,肝胰腺细胞部分线粒体肿胀破裂。上述研究表明,在干露-再浸润胁迫下,SpBAX和SpBcl-2蛋白通过调节线粒体膜的通透性控制细胞凋亡的发生。本研究可为拟穴青蟹干露胁迫的应答机制提供理论基础。综上所述,干露胁迫会损伤青蟹鳃的组织结构并造成氧化应激从而刺激抗氧化活性的上调防止氧化损伤。同时,干露胁迫下抑制凋亡蛋白SpIAP,SpBcl-2表达上调,从而抑制SpBAX和Caspase的活性,保护线粒体结构完整从而阻碍细胞凋亡的产生。干露-再浸润胁迫下,促凋亡蛋白SpBAX表达上调,使得BAX/Bcl-2比率升高,线粒体结构遭到破坏导致线粒体凋亡通路激活,Caspase-3活性升高最终导致细胞凋亡的产生。