破伤风是由广泛存在于土壤环境中的破伤风梭菌引起的,其孢子通过未经适当处理的皮肤或粘膜伤口进入人体,在厌氧条件下复苏和繁殖,分泌大量破伤风毒素（TT）,该毒素可逆行至中枢神经系统,阻断神经递质传递,引起患者全身肌肉痉挛或僵直,严重时危及生命。破伤风仍然是一个严重的公共健康问题,尤其在死亡率高的低收入地区。破伤风的预防与治疗主要包括灭活毒素（类毒素）破伤风疫苗进行主动免疫,以及基于马破伤风抗毒素（TAT）和人类免疫球蛋白破伤风（HTIG）的被动免疫。TTV主要用于长期预防,特别是在免疫力低下的儿童和老年人。用于短期破伤风预防的TAT是由马血浆制造的,存在较高的过敏反应及其他感染的潜在风险。HTIG价格昂贵,因为原料来源少,无法大规模生产,而且由于它是人类血液制品,存在感染人类病毒的潜在风险,例如肝炎、艾滋病等其他传染病。目前,医疗市场对TAT和HTIG有巨大的需求。此外,在严重的自然灾害和特殊的战争创伤时期,破伤风感染很容易发生并威胁到患者生命。因此,迫切需要一种价格合理、高效和安全的抗破伤风感染的新抗体。破伤风毒素由二硫键连接的一条轻链（L,50 kDa）和一条重链（H,100 kDa）组成。轻链（片段A）是一种锌金属蛋白酶,可阻断抑制性神经递质释放。而重链由片段B（50 kDa）和片段C（50 kDa）组成,前者发挥毒素转运作用,后者是神经元细胞结合毒素和内吞到囊泡中所必需的受体结合域。目前,开发针对片段A和C的抗体有很大潜力。此外,破伤风毒素片段C保留了许多特性,如与神经节苷脂的完整结合、与天然毒素相当的免疫原性、低毒性和低过敏性。因此,本研究的重点是通过破伤风毒素C片段进行免疫来制备人源化单克隆抗体,以解决抗破伤风感染所面临的困难。本研究基于人源化单克隆抗体开发平台,通过原核系统大肠杆菌感受态BL21（DE3）表达破伤风毒素C片段（TT-HC）、片段A和片段B,探索出诱导表达的最佳条件（0.1mM IPTG,16℃,16h）。用TT-HC蛋白作为免疫抗原对小鼠进行免疫,并将其脾细胞与P3X63Ag骨髓瘤细胞融合,得到可以无限增殖并产生抗体的杂交瘤细胞。以TT-HC为检测原,HTIG为阳性对照,通过间接ELISA从4608个细胞计数板孔中进行筛选,然后对符合条件的细胞株进行第一次亚克隆,成功分离出19个具有较高亲和力的单克隆抗体细胞株,并再次亚克隆获得5个具有高亲和力的单克隆细胞株,进一步提取mRNA,通过反转录、连接、转化、测序,得到单克隆抗体的氨基酸序列,并通过优化序列合成质粒,转染到Expi293细胞中,进行纯化,亲和力验证,筛选出最佳的单克隆抗体。通过生物工程将部分鼠源氨基酸序列替换为人源序列,并进一步转染真核细胞表达,得到人源化的单克隆抗体,在保持抗体的高亲和力的同时,降低了免疫原性,提高了临床治疗的安全性。这些单克隆抗体和人源化单克隆抗体进行了体外实验和小鼠体内中和实验,以验证其效价。本研究最终得到4个稳定和高亲和力的单克隆抗体（9E10,12C6,14C7和20G9）,其中亲和力最高的20G9被进一步人源化为H-20G9,并进行了体外试验和体内中和研究。破伤风毒素在小鼠体内的致死性保护试验中,单次注射50μg·kg-1的H-20G9,完全保护小鼠在20LD50剂量的毒素下存活。大约2.5 mg的H-20G9抗体对1支市售人免疫球蛋白（250 IU）具有同等效力。综上所述,我们获得了具有高亲和力的中和破伤风毒素的人源化单克隆抗体H-20G9,对抗破伤风感染具有很大的潜力。