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1.研究背景及目的心肌梗死（Myocardial Infarction;MI）是危害人类健康的重大疾病之一。炎症反应在MI的病理过程中扮演重要角色,有序适度的炎症反应是心肌梗死发生后心肌修复的前提条件之一,但过度的炎症反应亦会导致功能心肌的额外丧失,加重心肌损伤和心室重塑,NLRP3炎症小体是促进无菌炎症反应的关键介质,有研究表明,NLRP3炎症小体介导了缺血性损伤,并通过扩大炎症反应加重心肌损伤。线粒体是能量代谢的主要场所,心肌细胞中线粒体含量较多,约占其体积的40%,提供90%以上的能量,在MI发生发展过程中,持续的缺血缺氧刺激导致线粒体受损,受损线粒体释放大量线粒体ROS（mtROS）和氧化线粒体DNA（ox-mtDNA）进入胞浆,促使NLRP3炎症小体组装和活化,进而加重心肌损伤。线粒体自噬是负性调控NLRP3炎症小体激活的重要因素,可以通过清除受损线粒体以减少mtROS和mtDNA的释放,从而抑制NLRP3炎症小体的激活。因此本课题通过构建大鼠心肌梗死和H9c2大鼠心肌细胞缺血缺氧损伤模型,观察SL提取物对心肌梗死的作用及氧化应激的影响,在此基础上进一步探讨基于线粒体自噬SL提取物对NLRP3炎症小体活化的干预作用。2.研究方法2.1 SL提取物对MI大鼠的保护作用通过结扎冠状动脉左前降支复制大鼠心肌梗死模型,SD大鼠随机分为假手术组、模型组、SL提取物（62.16、124.32、248.64mg/kg）组、复方丹参片（259.20mg/kg）组、盐酸地尔硫卓（21.60mg/kg）组。给药3周后:（1）超声心动图结合血流动力学检测大鼠心脏结构和功能变化;（2）TTC染色检测心肌梗死范围;（3）酶法和ELISA法检测血清中心肌损伤标志物（CK-MB、CTnT）以及氧化应激指标（SOD、GSH-Px、MDA）水平;（4）HE染色检测心肌组织病理结构变化;（5）Masson染色检测心脏纤维组织变化。观察SL提取物对MI的保护作用。2.2 SL提取物调控线粒体自噬对MI大鼠NLRP3炎症小体的影响在2.1的基础上,通过:（1）TUNEL染色检测MI大鼠心肌组织细胞凋亡;（2）ELISA法检测血清中NLRP3炎症小体下游炎症因子IL-1β、IL-18水平;（3）免疫组织化学法检测心肌组织线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin以及炎症小体成份NLRP3蛋白表达;（4）Western Blot法检测线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I、P62、PINK1和Parkin以及NLRP3炎症小体活化相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18表达水平。以上研究进一步探究SL提取物调控线粒体自噬对MI大鼠NLRP3炎症小体的影响。2.3 SL提取物对H9c2细胞缺血缺氧损伤的保护作用以H9c2大鼠心肌细胞为研究对象,无糖无血清培养基于94%N2、1%O2、5%CO2三气培养箱缺氧培养24h,构建H9c2细胞缺血缺氧损伤模型。通过:（1）MTT法检测细胞活性;（2）Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡;（3）酶法检测细胞培养上清液中LDH、SOD、MDA水平。以上研究观察SL提取物对H9c2细胞缺血缺氧损伤的保护作用。2.4 SL提取物调控线粒体自噬对H9c2细胞NLRP3炎症小体的影响在2.3的基础上,通过:（1）荧光探针DCFH-DA流式细胞术检测细胞内活性氧水平;（2）JC-1荧光探针流式细胞术检测线粒体膜电位;（3）透射电镜观察细胞超微结构及自噬水平;（5）ELISA法检测NLRP3炎症小体下游炎症因子IL-1β分泌水平;（6）WesternBlot检测线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、PINK1和Parkin以及NLRP3炎症小体活化相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18表达水平。以上研究探讨SL提取物调控线粒体自噬干预NLRP3炎症小体而减轻心肌细胞损伤的作用机制。3.研究结果3.1 SL提取物对MI大鼠的保护作用（1）心脏结构和功能:超声心动图结果显示,与假手术组比较,模型组左心室前壁厚度（LVAWd/s）明显降低（P<0.01）,左心室后壁厚度（LVPWd/s）没有明显变化（P>0.05）,左心室内径（LVIDd/s）明显扩大（P<0.01）,而心功能参数射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）显著降低（P<0.01）;SL提取物可明显改善心功能,EF和FS水平较模型组显著提高（P<0.01）,同时LVAWd/s、LVPWd/s、LVIDd/s等指标均较模型组有所改善,其中SL提取物高剂量可以显著降低LVIDs（P<0.01）。血流动力学结果显示,与模型组比较,SL提取物可以显著提高LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmin,降低LVEDP（P<0.01）,改善心脏收缩与舒张功能。（2）心肌梗死范围:实验结果显示,SL提取物治疗3周后,大鼠心肌梗死范围较模型组显著降低（P<0.01）。（3）血清心肌损伤标志物及氧化应激指标:与模型组比较,SL提取物可以显著降低大鼠血清中CK-MB、CTnT水平（P<0.01）;提高 SOD、GSH-Px 活性,降低 MDA 水平（P<0.05 或P<0.01）。（4）HE染色:结果显示,假手术组大鼠心肌细胞排列整齐,结构完整正常,肌纤维排列紧密,纹理清晰,着色均匀,细胞核大小一致,位于中央,未见炎性细胞浸润;模型组心肌细胞肿胀,肌纤维空泡变性、排列紊乱,心肌细胞核散乱分布、胞浆淡染,伴有大量炎性细胞浸润;SL提取物干预后心肌组织病变程度较模型组明显减轻,心肌细胞坏死减少,心肌纤维排列相对整齐,仅见少量炎性细胞浸润。（5）胶原纤维Masson染色:结果显示,假手术组大鼠心肌组织结构正常,细胞间隙存在少量的胶原纤维,且心肌细胞排列整齐紧密;模型组大鼠心肌细胞大量坏死,被胶原纤维替代,心肌纤维化严重;经SL提取物干预后大鼠心肌组织结构相对模型组较为完整,心肌细胞排列较紧密,存留心肌细胞数目增加,仅较少部分被胶原纤维替代,心肌纤维化程度明显改善。3.2 SL提取物调控线粒体自噬对MI大鼠NLRP3炎症小体的影响（1）心肌细胞凋亡:TUNEL染色结果显示,假手术组心肌组织中仅存在少量的凋亡细胞,而模型组心肌组织中观察到大量的凋亡细胞,SL干预后凋亡细胞数量减少。凋亡指数计算结果同样显示:与模型组相比,SL提取物可以明显减低心肌细胞凋亡指数。（2）线粒体自噬:与模型组比较,SL提取物可以提高线粒体自噬水平,上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin表达,下调P62蛋白表达（P<0.01）。（3）NLRP3炎症小体活化:与模型组相比,SL提取物能明显抑制NLRP3炎症小体的活化,抑制NLRP3、Caspase-1蛋白表达,减少下游炎症因子IL-1β、IL-18 的表达和分泌（P<0.05 或P<0.01）。3.3 SL提取物H9c2细胞缺血缺氧损伤的保护作用通过建立H9c2大鼠心肌细胞缺血缺氧损伤模型,研究结果显示:与模型组相比,SL提取物可以明显提高H9c2细胞活性,减少细胞凋亡（P<0.01）;降低LDH和MDA水平,提高SOD活性（P<0.01）,对抗缺血缺氧导致的H9c2细胞损伤。3.4 SL提取物调控线粒体自噬对H9c2细胞NLRP3炎症小体的影响研究结果显示:（1）与模型组相比,SL提取物能明显降低细胞内ROS水平（P<0.05）,提高线粒体膜电位（P<0.05或P<0.01）;（2）透射电镜检测发现,模型组细胞线粒体肿胀,线粒体瘠断裂,部分线粒体膜破裂,可见自噬小体存在,SL提取物干预后,细胞线粒体损伤减轻,受损线粒体积累减少,同时见大量自噬小体存在;（3）与模型组相比,SL提取物组线粒体自噬水平明显增强,Western Blot检测结果显示线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、PINK1、Parkin表达明显增强,P62蛋白表达显著降低（P<0.05或P<0.01）;（4）与模型组相比,SL提取物能显著抑制炎症因子IL-1β分泌（P<0.01）,降低NLRP3炎症小体活化相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表达（P<0.01）。4.结论（1）本研究通过结扎冠状动脉左前降支建立MI大鼠模型。模型组大鼠心肌组织有明显梗死部位,血清中心肌损伤标志物CK-MB、CTnT水平明显增加,超声心动图结合血流动力学检测显示大鼠心功能明显下降,病理学检测可见明显心肌损伤,表明模型复制成功。（2）SL提取物能够有效缩小心肌梗死面积,降低氧化应激损伤,抑制炎症反应,改善心功能,从而对抗心肌缺血性损伤。（3）SL提取物可以明显提高细胞活性和抗氧化能力,增加ROS的清除,逆转线粒体膜电位下降,减少细胞凋亡,对缺血缺氧导致的H9c2细胞损伤具有保护作用,（4）SL提取物可能通过提高PINK1/Parkin介导的线粒体自噬水平,抑制了NLRP3炎症小体活化,从而发挥心肌保护作用。