背景稳定性冠心病是常见的慢性非传染性疾病,威胁着患者的生活质量和远期预后。目前,稳定性冠心病的管理以生活方式干预,强化药物治疗和减少危险因素为主。但即使经过有效管理,有些患者仍会出现心肌缺血症状。经皮冠状动脉介入治疗可降低心绞痛的发作次数,但会引起5%至10%的再狭窄风险,且难以改善心血管远期预后。以上问题表明,冠心病需要开发新的个体化治疗策略,来改善疗效和预后。中医药治疗通过个体化施治,在防治冠心病、改善患者生活质量方面具有独特优势。痰瘀互结证与血瘀证是冠心病最常见的中医证型,既往关于痰瘀互结证与血瘀证的生物学基础研究取得了阶段性成果,但也存在一些问题,如无法特异性地区分证候差异等。蛋白质组学与中医证候具有某些相似之处,两者都是机体即时功能状态的反映,研究蛋白质组学相当于从表层原因层面探究证候的微观物质基础。有鉴于此,本研究借助定量蛋白质组学技术和生物信息学方法,初步筛选冠心病痰瘀互结证与血瘀证的血浆蛋白质表达谱及两种证候间的蛋白质差异,希望明确冠心病痰瘀互结证与血瘀证的关键生物学过程,从而为中医证候的客观化研究与冠心病的个体化治疗提供依据。目的初步筛选冠心病痰瘀互结证与血瘀证的血浆蛋白质表达谱及两种证候间的蛋白质差异,希望明确冠心病痰瘀互结证与血瘀证生物学过程中的核心靶点和通路,为中医证候的客观化研究提供依据。方法1.基于DIA的冠心病痰瘀互结证与血瘀证的蛋白质测序。参照《稳定性冠心病诊断与治疗指南》、《冠心病心绞痛证候要素诊断标准》,共纳入研究对象15例,分为冠心病痰瘀互结证组、冠心病血瘀证组与健康对照组。在获取受试者的知情同意后,于清晨采集研究对象的空腹血浆,进行离心,获得蛋白质混合液。经过蛋白质提取、酶解、除盐后进行液相色谱分离及质谱鉴定。采用DIA扫描模式,将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,使用二级碎片离子进行蛋白相对/绝对定量,从而获得完整的肽段信息。使用Spectronaut Pulsar软件进行搜库与鉴定,得到蛋白质的原始定量数据。对原始数据进行预处理后,在Excel中进行统计分析,利用差异倍数及p.value筛选不同组之间差异蛋白质。并通过R语言的Ggplot2包绘制火山图进行可视化展示。2.冠心病痰瘀互结证与血瘀证的差异蛋白质功能分析。根据第一部分的差异蛋白质结果进行生物信息学分析:①GO富集分析:利用David数据库分析各组间差异蛋白质对应基因的富集情况,选取富集基因数在3以上的条目进行展示,利用R语言GOplot包绘制弦图。②KEGG信号通路查询:利用KEGG Mapper查询GO分析中已经富集到的差异基因,将Uniprot ID输入KEGG Mapper查询相关信号通路图,选取富集基因数在3以上的信号通路图进行展示。③蛋白质互作网络分析:利用String数据库检索差异蛋白质的互作网络,利用Cytoscape软件优化蛋白质互作网络,并通过计算节点数量得到核心蛋白质。结果1.在差异倍数为1.5倍时,冠心病痰瘀互结证组相比于健康对照组,共鉴定到19个蛋白质下调,9个蛋白质上调。上调的蛋白质包括:免疫球蛋白轻链可变区3D-15、免疫球蛋白重链可变区3-43、血管性血友病因子、过氧化物酶Peroxiredoxin-2、免疫球蛋白重链可变区 6-1、Mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase IA、免疫球蛋白重链可变区1-45、免疫球蛋白重链可变区3-9、S100A9蛋白。下调的蛋白质包括:胰岛素样生长因子1受体、血小板糖蛋白α链、免疫球蛋白重链可变区1-69、免疫球蛋白轻链κ型1-8、二肽基肽酶-Ⅳ、白蛋白、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、补体因子H相关蛋白2、胰岛素生长因子结合蛋白3、载脂蛋白C-I、转铁蛋白受体1、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物亚基、补体因子H相关蛋白4、细胞外基质蛋白1、补体因子H相关蛋白1、转化生长因子β、L选择素、补体因子H、胰岛素样生长因子2。冠心病血瘀证组相比于健康对照组,共鉴定到22个蛋白质下调,9个蛋白质上调。上调的蛋白质包括:免疫球蛋白轻链λ型可变区3-25、免疫球蛋白重链可变区3-23、免疫球蛋白重链可变区3-43、免疫球蛋白重链的恒定区域、免疫球蛋白重链可变区3-49、C反应蛋白、免疫球蛋白轻链λ型可变区6-57、免疫球蛋白重链可变区3-9、胰岛素样生长因子结合蛋白2。下调的蛋白质包括:免疫球蛋白轻链可变区1D-13、免疫球蛋白λ型多肽1、多聚蛋白2、Roundabout homolog 4、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂、胰岛素样生长因子结合蛋白复合物亚基、富含半胱氨酸酸性分泌蛋白类似蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白3、多泡体亚单位12B、白蛋白、L选择素、补体因子H、补体因子H相关蛋白1、血小板糖蛋白α链、含Ⅰ型血小板结合蛋白序列的解聚素样金属蛋白酶2、细胞间黏附分子2、细胞间黏附分子2、凝溶胶蛋白、载脂蛋白L1、维生素D结合蛋白、细胞外基质蛋白1、磷脂转运蛋白。冠心病痰瘀互结证组相比于血瘀证组,共鉴定到8个蛋白质下调,6个蛋白质上调。上调的蛋白质包括:IgG的Fc片段受体、Mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase IA、桥粒芯蛋白2、S100A9蛋白、结合珠蛋白相关蛋白、多聚蛋白2;下调的蛋白质包括:二肽基肽酶-Ⅳ、血小板反应蛋白1、免疫球蛋白轻链κ型3-7、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血小板因子4、免疫球蛋白重链可变区3-49、免疫球蛋白轻链κ型2-40、氨肽酶N。2.①冠心病血瘀证的关键生物学过程是补体参与的慢性炎症反应,关键信号通路是补体与凝血级联反应的通路,核心靶点是血管性血友病因子和补体因子H。②冠心病痰瘀互结证的核心生物学过程是血小板过度激活与细胞蛋白质代谢异常,其关键信号通路是补体与凝血级联反应的信号通路,生长激素的合成、分泌和作用信号通路,其核心靶点是血管性血友病因子、补体因子H、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、胰岛素样生长因子结合蛋白3。③冠心病痰瘀互结证和血瘀证表型差异的生物学基础和相关分子靶点尚不明确,可能与炎症和免疫反应有关。结论1.冠心病血瘀证的生物学过程与补体参与的慢性炎症反应有关,补体与凝血级联反应是关键信号通路,补体因子H和血管性血友病因子是核心靶点;2.冠心病痰瘀互结证的生物学过程与血小板过度激活和蛋白质代谢异常有关,补体与凝血级联反应亢进,生长激素的合成、分泌和作用减弱。血管性血友病因子、补体因子H、胰岛素样生长因子1等是其核心靶点;3.冠心病痰瘀互结证和血瘀证的生物学基础比较接近,“痰浊”可能带来更强的免疫炎症反应,或导致“正气减弱”。