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口腔颌面部因为肿瘤或者外伤造成的骨创伤和组织缺损一直是临床的难点。随着中国社会的飞速发展,口腔颌面部交通伤逐年增多,同时现代战争中对于颌面部的防护不足,造成战创伤中颌面部伤的发生率达全身伤10%以上。因此,创伤修复机制的研究一直是基础和临床研究的热点。骨创伤修复和愈合经历血肿形成,血肿机化,纤维骨痂的形成等一系列过程,包括免疫系统的参与,血管的生成和改建,成骨细胞的生成和募集。是一个由多细胞和多生长因子参与调控的复杂过程,在此过程中既有成骨细胞和成骨相关细胞分泌的细胞因子的调控作用,也有其他细胞通过旁分泌途径产生的各种激素和调节因子的作用。大量的实验证明周围神经系统分泌的神经肽类物质在骨创伤修复中有着重要的生物学意义,降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP),因在骨创伤愈合中发挥的至关重要的调控作用而受到广泛关注。在体内实验中通过基因敲除小鼠和转基因小鼠证明的CGRP具有明显的成骨正效应;体外实验中发现CGRP有促进成骨细胞(Osteoblast,OB)增殖作用,因而CGRP成为骨创伤愈合研究中的热点和主体。但近年来的研究发现神经系统也参与到骨创伤的修复和重建中,其中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经营养因子家族(neurotrophic factor;neurotrophic factors,NTF)的重要成员,存在于骨形成细胞中,通过上调成骨细胞活性,引导神经长入骨痂来促进骨的愈合。CGRP由神经末梢释放作用于靶细胞,而NGF由神经靶细胞释放,被神经末梢摄取,两者都具有明显的促成骨效应,两者是否有相互之间的信号联系和调节机制报道少见。本实验基于以上想法,体外培养成骨肉瘤细胞株MG-63细胞,通过NGF干预MG-63细胞,检测CGRP的表达状况,探讨NGF对骨修复过程中对CGRP的影响,以及对MG-63增殖和分化的作用,旨在加深对骨创伤愈合机制的认识,为临床颌骨骨创伤愈合治疗方法提供相关理论依据。方法:1.细胞培养:人骨肉瘤细胞株MG-63细胞株购买于ATCC公司,以8×106/瓶密度接种于100ml培养瓶中培养传代,加入含10%fcs的高糖dmem培养基,置于5%co2孵箱中37°c孵育48传代,3-5代细胞用于实验。2.ngf对mg-63细胞增殖分化的调控作用。2.1mg-63细胞增殖:elisa法检测ngf刺激mg-63细胞后cgrp表达;q-pcr法测cgrpmrna表达;cck-8法测mg-63细胞增殖。ngf浓度(0-100ng/ml),时效作用(1-4d)。2.2mg-63细胞分化:pnpp偶氮法检测ngf对mg-63细胞alp染色的调控作用(100ng/ml);茜素红染色检测ngf对mg-63钙化结节的量效作用(100ng/ml)。2.3.mg-63细胞中加入ngf受体阻断剂(pd98059):q-pcr法测cgrpmrna表达;cck-8法测mg-63细胞增殖。ngf浓度(0-100ng/ml),时效作用(1-4d)。3.mg-63细胞过表达ngf对cgrp的表达作用,以及对成骨标志物的表达作用。3.1.mg-63细胞过表达ngf:rt-pcr,western-blot检测cgrp以及mg-63细胞中alp、collageni的表达。时效作用(1-5d)。结果:1.ngf对mg-63细胞增殖分化的调控作用。1.1mg-63细胞增殖:elisa检测发现mg-63细胞自身可以产生少量的cgrp,在ngf作用下,可以明显上调mg-63细胞分泌的cgrp(p<0.05),而且随ngf浓度升高,cgrp有明显的浓度依赖性。mg-63细胞上清液中cgrp的浓度随不同浓度的ngf作用时间延长也相应增加(p<0.05)。rt-qpcr检测发现在ngf作用下,可以明显上调mg-63细胞分泌的cgrpmrna(p<0.05),而且随加入的ngf浓度升高,此作用也相应增强。此外,mg-63细胞总rna中cgrpmrna的浓度随不同浓度的ngf作用时间延长也相应增加(p<0.05)。cck-8法检测发现加入ngf阻断剂后的干扰组的mg-63细胞增殖效率明显低于其余两组(p<0.05),而实验组加入ngf刺激后mg-63细胞增殖效率明显高于空白对照组(p<0.05),而且随加入的ngf浓度升高,此作用也相应增强。此外实验组ng-63细胞增殖效率随不同浓度的ngf作用时间延长也相应增加(p<0.05)。1.2mg-63细胞分化:pnpp偶氮法检测发现ngf刺激mg-63细胞的alp表达量明显高于空白对照组(p<0.05);茜素红染色检测发现ngf刺激mg-63细胞茜素红染色计数高于对照组(p<0.05)。1.3mg-63细胞中加入ngf受体阻断剂:rt-qpcr检测发现在加入ngf阻断剂后,可以明显降低MG-63细胞分泌的CGRPm RNA(p<0.05),而且随加入的NGF浓度升高,此作用也相应增强。此外在3d为NGF阻断剂干扰时间的峰值(p<0.05)。2.MG-63细胞过表达NGF对CGRP的表达作用,以及对成骨标志物的表达作用。2.1 MG-63细胞过表达NGF:NGF过表达的慢病毒及空载体慢病毒转染MG-63细胞后Real-time PCR结果显示ALP、CollagenⅠ和CGRP的mRNA浓度比空载体组明显升高(p<0.05),且随着NGF作用时间延长也相应增加(p<0.05)。NGF过表达的慢病毒及空载体慢病毒转染MG-63细胞后WB结果显示ALP、CollagenⅠ和CGRP的表达量比空载体组显著升高(p<0.05),且随着NGF作用时间延长也相应增加(p<0.05)。结论:1.MG-63细胞自身可以产生少量的CGRP,在NGF作用下可以明显上调MG-63细胞分泌的CGRP的表达量,而且随NGF浓度升高,CGRP有明显的浓度和时间依赖性。2.通过对NGF的信号阻断可以有效抑制CGRP的表达,且在3d为NGF阻断剂干扰时间的峰值。3.NGF的表达能够对MG-63细胞分泌的CGRP等多种成骨标志物的表达量有促进作用,有明显的浓度依赖性和时间依赖性。