目的:哮喘是一种慢性异质性疾病,常以慢性气道炎症为主要特征,进而造成气道狭窄,影响肺部通气,导致患者呼吸困难。哮喘发生原因复杂,除了遗传易感性外,环境因素是导致近几十年来哮喘发病率增高的一个重要原因。研究报道,环境内分泌干扰物-双酚A（Bisphenol A,BPA）暴露可能与儿童哮喘发病风险增高有关。如母体尿中BPA浓度的增加与儿童哮喘症状和呼吸道感染风险的增加有关。3岁、5岁和7岁儿童尿中BPA水平与其哮喘发病风险增高有关。少数动物实验指出,BPA暴露可通过佐剂作用加重哮喘症状。但目前BPA暴露对肺功能影响的研究报道还比较少,BPA暴露影响哮喘发生发展的具体机制尚不清楚。BPA是一种具有雌激素活性的环境内分泌干扰物之一,是生产婴儿奶瓶、食品和饮料容器等多种消费品的主要原料,在一定条件下BPA可从产品中渗出,通过食物和水等途径进入人体。当BPA进入体内后,主要在肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶作用下形成BPA-单葡萄糖醛酸苷,然后通过肾脏随尿液排出。因此,尿中结合或/和游离形式的BPA水平可以反映机体暴露水平。2013-2016年美国国家健康与营养调查中发现,97.5%的6-19岁儿童青少年尿中检测到了BPA。2012年84.9%的上海8-15岁儿童尿中检测出BPA,几何均值为0.45 ng/m L。因此,BPA暴露对机体不良影响的研究引起广泛关注。而近年来对BPA的研究主要集中在生殖功能损伤、神经损伤和代谢紊乱方面,对免疫功能影响及相关过敏性疾病关联方面的研究报道相对较少。哮喘的发病机制是复杂的,目前尚不明确,但主要病理特征是常伴有持续性气道慢性炎症和免疫功能异常。炎症多以核因子κB（Nuclear factorκB,NF-κB）信号通路调控为主。免疫功能异常多表现为T辅助细胞1/2（T helper cell 1/2,Th1/Th2）和调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）/Th17细胞失衡等。而近年来有研究显示,表观遗传机制在环境污染物致儿童哮喘发病机制中具有重要作用。因此,近年来环境因素在儿童哮喘高发原因中的作用及机制研究成为热点。NF-κB蛋白是体内调控炎症反应的重要转录因子,也参与先天和适应性免疫、凋亡、增殖、应激反应和癌症进展等。有研究指出,BPA诱导雄性大鼠肝毒性是通过增加促炎因子进而激活了NF-κB。而BPA暴露是否可通过激活NF-κB信号通路从而加重哮喘小鼠肺部炎症反应还未见报道。哮喘的发生常伴有血清免疫球蛋白E（Immunoglobulin E,IgE）水平增高。过敏性疾病患儿体内Treg减少与血清IgE水平增高成线性关系。研究显示,产前和成年期小鼠暴露BPA都能减少Treg的数量。提示BPA暴露增加过敏性疾病发生风险可能与降低Treg水平、升高Th2水平有关。但BPA对T细胞分化增殖的影响可因BPA暴露剂量、途径、时间及生理状况等而出现差异。因此,BPA的免疫毒性作用及机制尚需进一步明确。近年来研究发现,细胞自噬与炎症反应具有相关性。研究指出,香烟烟雾可通过诱导肺巨噬细胞自噬增强来激活NF-κB进而引起气道炎症反应。但自噬与炎症的相关性在不同疾病中的表现有所不同。自噬活性主要受到哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（The mammalian target of rapamycin,mTOR）的调控。其中最具代表性的是I型磷酯酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）-蛋白激酶（Protein kinase B,Akt）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）信号通路。研究指出,BPA暴露可导致大鼠记忆功能减退,其机制是通过上调AMPK和下调mTOR进而激活自噬,导致炎症增强。目前BPA暴露对肺组织炎症和自噬影响的研究报道很少,那么BPA暴露可增加哮喘发病风险是否与BPA引起的自噬异常从而加剧肺部炎症反应有关尚不清楚。因此,研究自噬和炎症的相关性及其自噬在BPA暴露加重哮喘小鼠肺功能异常中的作用,对进一步阐明哮喘高发的原因及机制具有重要意义。mTOR除了与自噬调控有关,也是Tregs特异性标志分子Foxp3基因表达的负性调控因子。在CD4+T细胞中,PI3K或mTORC1受到抑制会增加Treg细胞分化。哮喘儿童常伴有血清IgE增高和Treg细胞下降,提示哮喘在以肺部炎症反应增加的同时,也伴有全身免疫功能异常。因此,BPA暴露对哮喘小鼠肺部炎症产生影响的同时,可能会影响全身的免疫功能。目前,全面系统研究BPA暴露对哮喘动物模型肺功能及免疫功能影响的研究未见报道。近年来,DNA甲基化的改变在免疫性疾病发生发展中的机制研究备受关注。研究发现,空气污染可诱导Foxp3基因位点的高甲基化,导致Treg细胞分化和功能受损,从而增加儿童哮喘发病风险及病情严重程度。但有关过敏性疾病的表观遗传机制研究还处于起始阶段,且有关基因甲基化在BPA暴露致免疫毒性作用中的机制研究报道很少。因此,探讨DNA甲基化在BPA暴露致Th免疫应答异常中的调控机制,对揭示近年来儿童过敏性疾病高发原因及分子机制具有重要意义。综上我们提出如下假设:1.青春期小鼠暴露BPA可加重卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的肺部炎症反应,其机制与BPA通过mTOR介导的信号通路引起自噬异常,进而加重炎症反应有关;2.BPA可通过mTOR信号通路或表观遗传机制影响脾脏Treg细胞分化增殖,降低Treg水平,导致Treg/Th17和Th1/Th2失衡,引起全身免疫功能异常,诱发哮喘的发生和发展。研究方法:1.动物实验:4周龄C57BL/6雌性小鼠40只,适应性喂养7天后,随机分为5组:对照组、OVA组、0.1μg/m L BPA+OVA（L-BPA+OVA）组、0.2μg/m L BPA+OVA（M-BPA+OVA）组和0.4μg/m L BPA+OVA（H-BPA+OVA）组。每组8只小鼠,BPA通过饮水方式染毒2个月。每周记录体重、摄食量和饮水量。OVA组在实验第一个月同对照组饮水一致,L-BPA+OVA组、M-BPA+OVA组和H-BPA+OVA组在实验第一个月进行相应BPA浓度染毒。染毒一个月后开始进行OVA致敏和雾化实验,小鼠处死前一天进行气道高反应性（Airway hyperresponsiveness,AHR）实验,收鼠时进行左肺支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）实验,取右侧一肺叶进行固定,其余肺叶放于-80℃冰箱保存于后续指标的检测;同时称量并记录肝和脾脏器重量,计算其脏器系数;流式细胞仪检测脾组织CD4+CD25+Foxp3（Treg）数量;血细胞计数仪和ELISA试剂盒分别检测BALF中白细胞总数、分类计数白细胞和TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6以及血清IgE水平;采用HE和PAS染色观察肺脏病理改变;采用免疫组化法检测小鼠肺脏LC3蛋白表达水平;采用Western blot和RT-PCR检测小鼠AMPK和PI3K/Akt信号通路及自噬相关蛋白和基因表达水平,NF-κB信号通路及免疫相关蛋白以及甲基化转移酶基因表达水平;采用BSP法检测小鼠脾脏Foxp3基因甲基化水平。2.体外细胞实验:选取小鼠白血病单核/巨噬细胞RAW264.7细胞,培养液选择含10%热灭活胎牛血清、10 m M HEPES、100μg/m L链霉素和100 U/m L青霉素的DEME。使用MTS法确定细胞实验采用的BPA（0.25、0.5和1μM）和氯喹（Chloroquine,CQ）剂量（7.5μM）。在所有实验中,细胞在培养基中分别用不同浓度（0.25、0.5和1μM）的BPA、CQ（7.5μM）以及BPA（0.25μM）±CQ（7.5μM）处理24小时。透射电镜观察BPA暴露对线粒体、内质网等细胞器的影响以及自噬体的形成情况;收集上清液检测IL-6和TNF-α水平;收集细胞检测自噬和炎症信号通路的蛋白和基因表达水平。结果:1.整体动物实验:（1）小鼠的生理状况:OVA组小鼠与对照组相比,体重无明显变化,摄食量和饮水量均明显减少,肺和脾脏器系数均明显增加;与OVA组相比,各剂量BPA组摄食量增加,饮水量减少,体重和脏器系数均无明显差异。（2）OVA诱导哮喘小鼠模型成功建立:小鼠经致敏后出现哮喘临床表型。与对照组相比,OVA组比气道阻力（Specific airway resistance,s Raw）值有显著增加,血清IgE水平明显升高,BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞数及TNF-α、IL-4、IL-5和IL-6水平均明显增加、气道结缔组织内嗜酸性粒细胞和淋巴细胞明显增多。（3）BPA暴露可加重哮喘小鼠肺通气阻力和炎症反应:与OVA组比较,BPA+OVA组小鼠s Raw值显著升高,血清IgE水平有所升高,BALF中白细胞总数、分类白细胞数及TNF-α、IL-4、IL-5和IL-6水平均显著增加。（4）BPA暴露对哮喘小鼠肺和脾组织炎症相关蛋白表达的影响:与对照组相比,OVA组小鼠肺和脾组织TLR4和NF-κB蛋白表达水平明显升高,IκBα的表达水平有所降低;BPA+OVA组比OVA组小鼠的TLR4和NF-κB蛋白表达水平高,而IκBα的表达水平有所降低。（5）BPA暴露对AMPK和PI3K/Akt信号通路调控的自噬相关蛋白和基因表达的影响:OVA组比对照组小鼠肺组织的TSC1、TSC2、AMPK、p-ULK1、Beclin1和LC3蛋白表达水平及Prkaa2、Ulk1、Becn1和Map1lc3b基因表达水平高,p-PI3K、p-Akt（Ser473和Thr308）、p-mTOR和p62蛋白及Pik3r1、Akt1、Mtor和p62/Sqstm1基因表达水平显著降低;与OVA组相比,除H-BPA+OVA组p-ULK1的蛋白表达下降外,L-BPA（或M-BPA）+OVA组TSC1、TSC2、AMPK、LC3和Beclin1蛋白表达及Prkaa2、Ulk1、Map1lc3b和Becn1基因表达水平明显上调,p-PI3K、p-Akt（Ser473和Thr308）、p-mTOR和p62蛋白及Pik3r1、Akt1、Mtor和p62/Sqstm1基因表达水平有所降低。（6）BPA暴露对哮喘小鼠脾脏mTOR介导的信号通路调控T细胞分化的影响:与对照组相比,OVA组小鼠脾脏Treg细胞比例明显降低,Fox P3、T-bet和p-AMPK蛋白水平明显下调,而RORγT、GATA3、p-PI3K、p-Akt（Ser473和Thr308）、p-mTOR和p70S6K的蛋白水平明显上调;与OVA组相比,BPA+OVA组Treg细胞比例明显降低,GATA3、RORγT、p-PI3K、p-Akt（Ser473和Thr308）、p-mTOR和p70S6K的蛋白表达显著升高,T-bet、Fox P3和p-AMPK蛋白水平有所下降。（7）BPA暴露对哮喘小鼠脾组织Treg基因甲基化水平的影响:与对照组相比,OVA组小鼠脾脏的甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的基因表达高,Foxp3甲基化水平有所上调;与OVA组相比,BPA+OVA各组Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的基因表达水平显著升高;但只有L-BPA+OVA和M-BPA+OVA组Treg基因总体甲基化水平明显增高;M-BPA+OVA组Foxp3中Cp G的143和159位点甲基化率明显升高。高剂量BPA+OVA组对Treg基因的甲基化水平没有明显影响,其原因有待进一步研究。2.体外细胞实验:（1）BPA暴露对RAW264.7细胞炎症和自噬相关蛋白或基因及相应信号通路的影响:与对照组相比,随着BPA染毒剂量的增加,TNF-α和IL-6水平升高;TLR4、NF-κB、LC3、p-ULK1和Beclin1蛋白表达水平明显上调,而IκBα、p-mTOR和p62的蛋白表达水平下调;Map1lc3b、Becn1、Ulk1、Tlr4和Nfkb1基因表达水平明显上调,而p62/Sqstm1、Nfkbia和Mtor基因表达水平逐渐下调。在0.25μM BPA处理组,细胞超微结构出现明显改变,不规则的细胞核、细胞器受损严重、核膜不完整、可见双层膜小泡。（2）采用自噬抑制剂CQ后,BPA对RAW264.7细胞炎症和自噬相关蛋白和基因表达水平的影响:与BPA组相比,BPA+CQ组TNF-α和IL-6水平显著下调;自噬体数量增加;TLR4、NF-κB、Beclin1和p-ULK1的蛋白表达水平明显降低,而p-mTOR、IκBα、p62和LC3的表达水平明显上调;Mtor、Map1lc3b、p62/Sqstm1和Nfkbia基因表达水平上调,Becn1、Ulk1、Tlr4和Nfkb1基因表达水平逐渐下调。结论:1.BPA暴露可加重哮喘小鼠肺部炎症反应,其机制与BPA下调PI3K/Akt信号通路和上调AMPK蛋白表达进而激活自噬有关。2.BPA暴露可导致RAW264.7细胞炎症因子、炎症蛋白以及自噬相关蛋白表达水平均增高;抑制自噬后,炎症反应减轻;进一步验证了BPA暴露加重哮喘小鼠肺炎症反应的机制与其激活自噬有关。3.BPA暴露可引起哮喘小鼠血清IgE增高及脾脏中Treg细胞比例下降,其机制可能与mTOR介导的信号通路的激活和表观遗传异常有关,因此,BPA可通过多途径影响过敏性疾病的发生发展。