目的:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)正迅速成为世界范围内最主要的肝病病因之一,其发病率的增加与肥胖的流行以及肥胖相关的代谢紊乱有关。近30年来,随着儿童肥胖率的不断升高,儿童NAFLD的发病率也在快速增加。最近一项Meta分析报道:NAFLD在一般儿童中的患病率为7.6%,而在肥胖儿童中高达34.2%。美国儿童NAFLD患病率为3%～11%,亚洲及中国儿童NAFLD患病率分别为6.3%和3.4%。北京中小学生肥胖检出率为19.5%,其中10%出现脂肪肝,而超重肥胖儿童中NAFLD的检出率为44.5%。最近人们认识到NAFLD不仅存在于肥胖人群,也存在于体重正常人群中。NAFLD发病原因和机制复杂,目前尚不明确,其特点是肝脏脂肪堆积。因此,膳食能量摄入过多,活动过少经常被认为与肥胖、脂肪代谢异常和NAFLD的发生有关。最近研究显示,双酚A(Bisphenol A,BPA)和果糖暴露均可增加NAFLD发生风险,但是具体机制还不清楚。BPA是一种具有雌激素活性、产量最高的环境内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)之一,人类每天摄入的BPA主要是通过食物和饮料产生的,但也可通过热敏纸小票与皮肤持续接触而暴露,由于这些多重来源和日常接触,导致人类广泛而持续地低剂量接触BPA。越来越多的证据表明,BPA暴露可以增加肥胖、胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)和血脂异常的风险。果糖为常见的单糖,是葡萄糖的同分异构体,其以游离态大量存在于水果和蜂蜜中。随着食品加工业的快速发展,利用发酵方法将玉米深加工生产出的高果糖玉米糖浆(High fructose corn syrup,HFCS),因其生产成本低、保质期长,自20世纪70年代以来作为甜味剂被广泛应用于几乎所有的软饮料、蛋糕和包装食品中。HFCS由55%的果糖、41%的葡萄糖和4%的复合多糖组成,即使在没有肥胖的情况下,高果糖摄入也会导致严重的健康问题,如肝脂肪堆积、血脂异常和NAFLD,这可能与肝脏脂肪从头合成(de novo lipogenesis,DNL)增加、内质网应激和脂肪合成基因表达增加有关。最近有研究表明,尿液中BPA含量的升高与成人和青少年NAFLD发生有关。高果糖饮料的过量摄入被认为是成年人和儿童NAFLD的主要诱因之一。考虑到BPA和果糖经常在日常生活中通过食物和饮料同时暴露,而孕期和哺乳期BPA和果糖联合暴露是否会加重子代NAFLD的发生发展目前还不清楚,因此二者对NAFLD发生发展的影响及机制需要进一步研究。越来越多的证据表明,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的激活导致肥胖、T2DM和恶性肿瘤的发生。mTOR是磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinosotol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)通路的下游靶点,可调控细胞生长和自噬,并可通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)和固醇调节元件结合蛋白1(Sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP1)调控脂质合成。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)被称为生物体内能量调控的开关,通过抑制肝脏脂肪生成和刺激脂肪酸氧化来控制多种细胞过程,如脂质代谢。AMPK的激活不仅可以导致mTOR活性的抑制来激活自噬,也可以直接通过ULK1激活自噬。自噬受损与多种疾病的发生有关,如T2DM、肥胖、神经退行性变、癌症和衰老。炎症反应增强也被证明是NAFLD等代谢性疾病发生的关键诱因。炎症反应的特征是炎症信号通路的激活,如核因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)信号通路,以及异常促炎细胞因子的产生,包括IL-1β、IL-6和TNF-α。NF-κB信号通路在代谢性疾病,包括NAFLD,特别是肝脏炎症中起着至关重要的作用。综上,本研究通过生命早期BPA和果糖联合暴露是否可加重NAFLD的发生发展,探讨mTOR介导的自噬和脂代谢异常在生命早期BPA和果糖暴露致NAFLD发生发展中的作用。为探寻近年来儿童NAFLD的高发原因及机制,采取有针对性的防治措施提供实验依据,也为进一步制定生命早期BPA的暴露阈值和果糖的适宜摄入量提供理论依据。研究方法:随机将30只SD孕鼠分为对照(Control)组,1μg/m L BPA(LBPA)组,10μg/m L BPA(HBPA)组,10%果糖(Fructose)组和1μg/mL BPA+10%果糖(LBPA+Fructose)组,每组孕鼠为6只。从妊娠第6天(Gestational day 6,GD6)开始,各组孕鼠饮用含BPA和/或果糖的水,至哺乳期结束。仔鼠在产后21天时断乳,子代雌雄分笼。断乳后的5周内,仔鼠均饮用不含BPA和/或果糖的水。整个实验过程中,母鼠和仔鼠置于温度24±1°C,湿度45±5%,12 h昼夜周期的环境中,自由摄食和饮水,每天记录母鼠和仔鼠的摄食量和饮水量,每周记录母鼠和仔鼠的体重。实验结束后,每窝随机选取两只雌鼠两只雄鼠,即雌/雄鼠均n=12/组。测量母鼠和仔鼠血糖和收缩压,采用ELISA检测仔鼠血清糖化血红蛋白、胰岛素、血脂和肝功能指标、瘦素和炎症因子水平,测量仔鼠肝脏TG和T-CHO水平,采用油红O染色和HE染色观察肝脏和脂肪组织病理学变化,采用免疫组化检测仔鼠肝脏LC3B和p62蛋白表达水平,采用RT-PCR检测仔鼠肝脏脂肪合成和分解酶mRNA表达水平,采用Western blot检测仔鼠肝脏脂肪合成和分解酶、胰岛素信号通路、PI3K/Akt/mTOR信号通路、自噬以及NF-κB信号通路相关蛋白表达水平。结果:1、整个孕期和哺乳期,各组母鼠体重间没有明显差异,但BPA和/或果糖暴露组母鼠的Lee’s指数、血糖和收缩压明显升高,而且LBPA+Fructose组内脏脂肪系数显著高于对照组和单独暴露组。染毒开始后,与对照组相比,Fructose组和LBPA+Fructose组母鼠摄食量和蛋白质摄入量明显减少,饮水量明显增加,第二周(Week 2,W2)母鼠总能量摄入量明显增加,W4母鼠总能量摄入量明显减少,而W3、W5和W6母鼠总能量摄入量没有明显差异;与LBPA组相比,LBPA+Fructose组母鼠摄食量和蛋白质摄入量明显减少,饮水量明显增加,W2母鼠总能量摄入量明显增加,而W3-W6母鼠总能量摄入量没有明显差异。子代雌鼠中,与对照组相比,W7 LBPA组和HBPA组体重高于对照组,W8 LBPA组、HBPA组、Fructose组和LBPA+Fructose组体重均高于对照组;子代雄鼠中,与对照组相比,各实验组体重均没有统计学差异。各实验组子代Lee’s指数、收缩压和内脏脂系数明显升高,血清TG、T-CHO、LDL-C、AST、ALT、IL-6和TNF-α水平显著升高,而HDL-C水平明显下降,LBPA组、HBPA组、Fructose组和LBPA+Fructose组子代雌鼠HOMA-IR显著升高,LBPA组和LBPA+Fructose组子代雄鼠HOMA-IR显著升高。2、与对照组相比,LBPA组、HBPA组、Fructose组和LBPA+Fructose组子代雌鼠和雄鼠肝脏TG和T-CHO水平明显升高;与LBPA或Fructose组相比,LBPA+Fructose组子代雌鼠肝脏TG和T-CHO水平,和子代雄鼠肝脏T-CHO水平明显升高。肝脏和脂肪组织病理学检测显示肝细胞脂质蓄积明显增加,脂肪细胞的大小和体积明显增大,而且联合暴露组较单独暴露组严重。子代雌鼠和雄鼠肝脏ERα、ObR、ZAG和HSL蛋白水平明显降低,PPARγ、SREBP1和FAS蛋白水平明显升高,低剂量BPA和果糖联合暴露对升高子代肝脏PPARγ和SREBP1蛋白水平,降低子代肝脏ERα、ZAG和HSL蛋白水平的作用大于单独暴露。3、与对照组相比,LBPA组、HBPA组、Fructose组和LBPA+Fructose组子代雌鼠和雄鼠肝脏p-PI3K、p-Akt(S473)、p-Akt(T308)、p-mTOR、mTOR、p70S6K、p-AMPK、p-ULK1、ULK1、Beclin1、LC3B、p62、TLR4和NF-κB蛋白水平显著升高,InsR、p-IRS-1、IRS-1、TSC1、TSC2和IκBα蛋白水平显著下降,而PI3K、Akt和AMPK蛋白水平没有统计学差异。与LBPA组或Fructose组相比,LBPA+Fructose组子代雌鼠肝脏InsR、p-IRS-1、IRS-1、TSC1和TSC2蛋白水平明显降低,p-PI3K、p-Akt(S473)、p-Akt(T308)、p-mTOR、mTOR、p-AMPK、p-ULK1和ULK1蛋白水平显著升高;子代雄鼠肝脏p-PI3K、p-Akt(T308)、mTOR、p70S6K、p-AMPK、p-ULK1、ULK1、Beclin1、p62和NF-κB蛋白水平显著升高,p-IRS-1、TSC1和TSC2蛋白水平显著下降。结论:1、生命早期BPA和/或果糖暴露可导致子代雌鼠和雄鼠内脏脂肪含量明显增多,出现收缩压升高、IR、血脂异常和肝脏脂肪蓄积,诱发NAFLD,并且BPA和果糖联合暴露可加重肝脏脂肪变性;肝脏脂肪蓄积与PI3K/Akt/mTOR信号通路激活介导的PPARγ和SREBP1上调促进脂肪合成,及ZAG下调进而使脂肪分解下降有关。2、生命早期BPA和/或果糖暴露可导致肝脏自噬相关蛋白激活,但出现自噬降解受损(p62蛋白表达增加),同时可激活TLR4/NF-κB炎症信号通路,下调肝脏胰岛素信号通路蛋白InsR、p-IRS-1和IRS-1,引起IR发生,因此,生命早期BPA和/或果糖暴露导致肝脏IR与自噬异常和炎症激活有关。3、生命早期BPA和/或果糖暴露可下调肝脏ERα和Ob-R蛋白表达,上调AMPK蛋白表达,导致瘦素抵抗和能量代谢异常,进一步加重肝脏IR,因此生命早期BPA和/或果糖暴露可通过多途径引起IR,增加NAFLD发生风险。4、生命早期BPA和/或果糖暴露可引起内脏脂肪质量增加,与脂肪细胞体积增大、脂肪含量增加有关。因此,生命早期BPA和/或果糖暴露诱发NAFLD可能与肝脏IR和全身IR有关,其机制需要进一步研究。