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目的本研究以4-壬基酚(4-NP)和双酚A(BPA)为受试物,研究4-NP和BPA联合染毒对子代雄性大鼠生殖功能的影响及其作用机制。方法1、采用2×2析因设计的方法,将21 d SD大鼠48只(雄鼠12只,雌鼠36只),将雌雄鼠采用随机数字法随机分为4组[对照组、4-NP组(5 mg/kg)、BPA组(0.5 mg/kg)、4-NP+BPA组(5 mg/kg+0.5 mg/kg)],适应性饲养后,将配好的染毒液对雌雄大鼠进行隔天灌胃给药(5 ml/kg),至大鼠55 d,雌鼠发情后,同组雌雄鼠3:1合笼,采用阴道涂片镜检观察是否受孕,将发现阴栓或者阴道涂片镜检看到大量精子且处于动情期的雌鼠判断为怀孕,将其分离出来单独饲养,继续灌胃直至哺乳期结束的时间段内分别对孕鼠进行灌胃染毒,得到的F1代雄鼠每组随机取6只.饲养至60 d,取相应组织。2、采用血细胞计数法对精子数量进行计数,HE染色法观察睾丸组织的结构,透射电镜观察自噬的发生情况,比色法测量氧化应激的相应指标,采用RT-PCR检测Akt、mTOR、4EBP1、p70S6K基因的表达,采用蛋白印迹法测量Akt、p-Akt、p-4EBP1、p-p70S6K、LC3蛋白的表达情况。结果1、体重变化和脏器系数:与对照组相比,仅4-NP组体重下降具有差异(P<0.05);联合组的体重比4-NP组小(P<0.05);同时睾丸重量和睾丸系数的分析中,4-NP组、BPA组以及联合组的睾丸重量的下降与对照组具有差异(P<0.05),联合组与单独染毒组间也具有差异(P<0.05);4-NP组、BPA组的睾丸系数与对照组具有差异(P<0.05),联合组仅与4-NP组有统计学意义(P<0.05);其余各组间无统计学差异(P>0.05)。析因方差分析,联合染毒对大鼠体重、睾丸重量的交互作用显示为拮抗作用(P<0.05)。2、精子数量:与对照组比较,BPA组和联合组的精子数量下降(P<0.05);析因方差分析显示没有具体的联合作用效应(P>0.05)。3、HE染色结果:在4-NP、BPA以及联合组中,各层次的组织细胞不如对照组的紧凑,组织间的间隙增大,少部分组织可见组织的排列混乱,管腔内精子数量较少。4、睾丸组织氧化应激:睾丸组织中SOD、GSH-PX的活力较对照组均下降,其中GSH-PX活力的变化中,与对照组相比较,仅BPA组具有差异(P<0.05),联合组和BPA组间有差异(P<0.05),其他无统计学意义(P>0.05);SOD活力的变化中,BPA组和联合组与对照组有差异(P<0.05),同时联合组与4-NP组也具有统计学差异(P<0.05),其他各组间无明显差异(P>0.05);而MDA含量较对照组的上升,联合组与对照组以及各单染毒组具有差异(P<0.05)。析因结果显示,联合染毒对GSH-PX活力的变化具有拮抗作用。5、睾丸组织Akt、mTOR、4EBP1、p70S6K m RNA的相对表达:睾丸组织中Akt、mTOR、p70S6K基因的表达较对照组下降,而4EBP1基因的表达上升。其中Akt基因的表达变化中,4-NP组与对照组以及联合组具有差异(P<0.05);mTOR基因的表达变化中,BPA组与对照组以及联合组具有差异(P<0.05);p70S6K基因的表达变化中仅有4-NP组与对照组具有差异(P<0.05);4EBP1基因的表达变化中,各染毒组与对照组具有统计学差异(P<0.05);其余各组间均无统计学差异(P>0.05)。析因分析显示联合染毒对Akt、4EBP1的影响为拮抗作用(P<0.05)。6、睾丸组织中Akt、p-Akt、p-p70S6k、p-4EBP1、LC3蛋白的相对表达:Akt、p-p70S6K、p-4EBP1蛋白的相对表达较对照组均有所下降,其中各染毒组与对照组相比,具有统计学差异(P<0.05),联合组与各单独染毒组相比也具有统计学意义(P<0.05);自噬蛋白LC3-I的表达变化不明显,但是LC3-II的表达较对照组略有上升(P<0.05),LC3-II/LC3-I的比值有上升的趋势,且各染毒组与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。析因分析结果显示Akt、p-p70S6K、p-4EBP1、LC3-II/LC3-I的比值的联合作用具有统计学差异(P<0.05),其联合作用的类型为拮抗作用。结论1、4-NP和BPA联合染毒可使子代雄性大鼠体重下降,睾丸的正常组织结构遭到破坏,精子数量下降,影响正常的雄性生殖功能。2、4-NP和BPA联合染毒可致使子代雄性大鼠组织产生氧化应激,抑制Akt/m TOR通路,诱导自噬。3、综合所有的析因分析,可初步判断4-NP和BPA联合染毒对子代雄性大鼠的雄性生殖影响的联合作用类型主要为拮抗作用。