背景:近年来,全球女性总癌症发病率处于稳定的状态,但是乳腺癌却呈现高发病率趋势,并成为全球女性致死率排名第二的恶性肿瘤[1]。目前,乳腺癌常用治疗手段有:手术治疗、放化疗、内分泌治疗及靶向治疗等,虽然这些治疗方法可以有效控制乳腺癌的发展,但乳腺癌患者的死亡率依然高达15%,而引起患者死亡的最主要原因之一就是肿瘤转移[2,3]。但不是所有的肿瘤都能够形成转移瘤,其过程是非常复杂的,需要通过多种基因及多条通路调控。原发肿瘤细胞间的粘着性降低,脱落后黏附在循环内皮细胞上,进一步增殖,诱导血管生成,形成转移瘤,此时才会出现肿瘤转移灶或发生转移灶的再次转移[4]。原发肿瘤可以通过手术、放化疗等手段得到抑制,但这些治疗手段在抑制肿瘤复发及转移方面并不理想[5]。相对于西药易出现耐药性及肿瘤复发性,中医药治疗因其整体观、辩证观,在临床治疗上体现出良好的药物协同作用,且中药成分复杂,靶点众多,人体生物利用度较好,在提高患者术后、放化疗后机体免疫力,抑制肿瘤复发、转移以及降低肿瘤耐药性等方面具有显著优势。地榆,味苦、气微寒,既可止血又能行血。利用现代药理学手段研究地榆后发现,地榆可以调节机体免疫系统,并具有抑制肿瘤血管生成的作用,因此地榆已广泛应用于乳腺癌、肝癌、白血病等恶性肿瘤的临床治疗,并取得了一定的疗效[6]。广义的自噬是指溶酶体将传递的细胞内、外亚结构进行降解的过程,当细胞出现营养不足或处于其他恶劣环境时自噬对细胞内环境保持稳定[7]、供给细胞新的能量物质[8,9]以及应对病理状态是非常重要的。近年来,细胞自噬与肿瘤关系的研究越来越多。细胞自噬是一个被精细调控的过程,它既能够通过吞噬清除致突变的有害物质来抑制肿瘤发生,又可以为肿瘤细胞提供营养物质进而促进肿瘤生长、转移。然而,自噬影响肿瘤转移的机制尚未完全明确。目的:研究地榆对高转移性乳腺癌细胞增殖、侵袭、凋亡、自噬及转移等方面的作用,并探讨其作用机制。方法:1、使用不同浓度的地榆(0、50、100、200 μ g/ml)处理高转移性乳腺癌细胞,并利用MTT、克隆形成实验、细胞流式术、Hoechst 33258细胞核染色法、细胞划痕实验及Transwell小室侵袭实验研究地榆对乳腺癌细胞增殖、克隆形成、凋亡、划痕愈合及迁移能力的影响;同时也利用Western Blot实验观察不同浓度的地榆分别处理乳腺癌细胞(0、24、48、72h)后转移相关蛋白的表达变化情况。2、通过TCMSP获得地榆活性成分,并筛选出口服利用度较高的候选化合物;使用OMIM获得乳腺癌相关基因;利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI);使用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点网络”、“化合物靶点-乳腺癌靶点蛋白互作网络”;运用MCODE对网络进行分析,并使用DAVID对模块中的基因进行生物过程(biologicalprocess,BP)富集,分子功能(molecularfunction,MF)富集,细胞组分(cellular component,CC)富集及KEGG通路富集分析。3、不同浓度的地榆(0、50、100、200 μ g/ml)处理乳腺癌细胞后,使用Western Blot实验检测LC3和P62蛋白变化;使用透射电镜观察乳腺癌细胞自噬体变化;使用LC3自噬双荧光慢病毒感染乳腺癌细胞,通过超高分辨率激光共聚焦显微镜观察不同浓度地榆对乳腺癌细胞自噬流的影响;对乳腺癌细胞进行DQ-BSA(荧光染料-牛血清白蛋白)与LysoRED(溶酶体红色荧光探针)双染色,观察地榆作用后溶酶体功能变化。4、分别使用自噬早期抑制剂3-MA、Wortmannin,自噬晚期抑制剂CQ、Bafilomycin Al处理乳腺癌细胞,进一步评估地榆对乳腺癌细胞自噬通量的影响;接下来,对细胞进行EBSS饥饿处理,同时联合使用地榆,通过Western Blot实验观察自噬标志蛋白LC3、P62、转移相关蛋白的表达情况;并观察EBSS饥饿处理后地榆对细胞划痕愈合能力的影响;采用超高分辨率激光共聚焦显微镜进一步观察乳腺癌细胞自噬流的变化。5、使用不同浓度地榆(0、50、100、200 μ g/ml)处理乳腺癌细胞,同时使用100μ g/ml的地榆处理0、24、48、72h后,利用Western Blot及免疫荧光技术检测细胞HiF-1α与Caveolin-1的表达情况;瞬时转染pENTER-HiF-1α质粒使乳腺癌细胞中HiF-1α表达上升,转染siRNA干扰Caveolin-1使其表达下降;将乳腺癌细胞MDA-MB-231 分为 6 组:(A)Negative Control 组(NC 组)、(B)地榆组(100μg/ml)、(C)地榆+Vector 组、(D)地榆+pENTER-HiF-1α 质粒组、(E)地榆+Vector+siControl组、(F)地榆+pENTER-HiF-1α质粒+siCavoelin-1组,通过Western Blot实验观察各组中HiF-1α、Caveolin-1、LC3、P62以及转移相关蛋白的表达情况;同时,通过细胞划痕实验观察HiF-1α、Caveolin-1对乳腺癌细胞迁移能力的影响;最后,我们使用超高分辨率激光共聚焦显微镜进一步观察HiF-1α、Caveolin-1对乳腺癌细胞自噬流变化的影响。6、构建裸小鼠乳腺癌原位肿瘤模型与斑马鱼乳腺癌异种移植模型,施加地榆后,通过观察肿瘤大小及转移情况研究地榆的体内作用。结果:1、地榆可以显著抑制高转移性乳腺癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭及转移能力,诱导乳腺癌细胞凋亡,并且呈现出时间及剂量依赖性。2、在地榆抗乳腺癌转移机制的网络药理学研究中,通过对“药物-成分-靶点网络”、“化合物靶点-乳腺癌靶点蛋白互作网络”、BP富集,、MF富集、CC富集以及KEGG通路富集分析显示,自噬可能是地榆抑制乳腺癌转移的关键机制之一;Caveolin-1是地榆抗转移作用的关键靶点之一;而HiF-1α信号与地榆的抗乳腺癌机制密切相关。3、与对照组相比,地榆处理组中自噬标志蛋白LC3与P62均增加,且细胞中自噬小体数量上升,自噬溶酶体数量下降,溶酶体功能也得到了抑制,表明地榆具有自噬后期抑制作用。4、地榆通过抑制自噬体的降解达到自噬后期抑制作用;进一步使用EBSS诱导自噬后,地榆诱发了 LC3Ⅱ更显著的积累,阻断自噬下游并通过介导自噬显著抑制乳腺癌细胞转移。5、对乳腺癌细胞施加地榆后,HiF-1α与Caveolin-1蛋白表达均下降;通过pENTER-HiF-1α质粒转染及siRNA干扰Caveolin-1表达后,细胞中HiF-1α表达显著上升,Caveolin-1表达下降;地榆可能通过HiF-1α影响Caveolin-1进而影响乳腺癌细胞自噬和转移;HiF-1α/Caveolin-1对乳腺癌细胞自噬流具有促进作用;地榆可能通过HiF-1α影响Caveolin-1进而抑制乳腺癌细胞的迁移能力,并调控转移相关蛋白的表达。6、地榆处理组中裸鼠肿瘤生长明显比对照组缓慢,且肿瘤体积明显小于对照组;斑马鱼肿瘤转移模型组中,地榆处理组的肿瘤荧光强度明显降低,而散播的肿瘤灶数目也明显减少。地榆可以有效延缓体内乳腺肿瘤生长并抑制其转移。结论:乳腺癌的发生、发展及转移与自噬相关,地榆通过HiF-1α/Caveolin-1抑制乳腺癌自噬从而介导乳腺癌转移。