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单倍体仅含有单一亲本染色体组,经加倍后可迅速获得基因型纯合、性状一致的DH系,相比连续自交7-8代获取纯系的传统育种方式,单倍体育种可以大大缩短育种年限,是一种高效的作物育种途径。同时,单倍体对基因功能鉴定、细胞学研究、突变体筛选等基础研究具有重要意义。单倍体可自发产生也可由人工诱导,但自发产生频率极低,人工诱导成本高且易受植物本身的基因型限制,这在很大程度上制约了单倍体的开发应用。2010年,Ravi等在研究拟南芥cenh3突变体时开发了基于着丝粒蛋白改造变体的新型单倍体诱导系,用H3.3组蛋白尾部结构域及GFP标签蛋白替换原有的尾部结构域,构建GFP-tailswap基因以挽救cenh3突变体的胚胎致死性,转入GFPtailswap基因的cenh3突变体与其他拟南芥杂交得到的后代中,来自GFP-tailswap植株的染色体全部消失,形成只含有另一亲本染色体组的单倍体,在拟南芥中可高效产生父本或母本单倍体。由于CENH3蛋白在真核生物中的高度保守性,着丝粒介导法诱导单倍体具有应用于多种植物的可能性。甘蓝是十字花科重要蔬菜作物,其单倍体育种进展缓慢。因此,通过甘蓝CENH3基因的表达调控开发高效的甘蓝单倍体诱导系具有重要的应用价值。本研究利用CRISPR/Cas9技术在甘蓝中同时突变了CENH3基因和自交不亲和调控基因SRK,在构建GFP-tailswap基因表达载体的基础上,转化甘蓝获得相应转基因植株。主要结果如下:1.获得cenh3突变背景甘蓝材料。构建基于CENH3基因调控的单倍体诱导系前提是下调内源CENH3基因的表达。本研究利用CRISPR/Cas技术对甘蓝基因组中的CENH3基因及自交不亲和关键基因SRK进行编辑。构建以Bar基因为筛选标记的双敲除载体pCas-tBoCENH3-ABCD/tBoSRK-ABCD,利用农杆菌介导法转化甘蓝自交不亲和系9025(属SRK3单倍型),获得pCas-tBoCENH3-ABCD/tBoSRK-ABCD转基因植株19株(来源于一个愈伤),对其中12个单株进行检测,除6号单株为SRK基因单敲除外,其余均为双敲除,BoCENH3基因突变频率为91.67%,BoSRK基因突变频率为100%,双突变的频率为91.67%。在突变的植株中,基于单克隆测序结果发现,除了1株为CENH3/SRK杂合突变外,其余均为纯合突变。对比野生型对照株,CENH3基因敲除植株株型矮小,苗期叶缘锯齿状明显。出现大片段缺失突变的1号植株花瓣发育畸形,伴随花瓣数量增加、雄蕊瘦弱扁平粘连的现象。花粉活力检测及细胞学观察结果显示,敲除植株花粉活力下降,且畸形花粉粒较多,部分植株成熟期药室不开裂、无明显花粉粒形成;敲除植株与野生型对照的胚珠发育情况无明显差异,表明cenh3突变体的雌配子未受到明显的影响。花粉原位萌发荧光显微观察结果显示,敲除植株作为母本进行花期杂交时,父本互补植株的花粉粒吸附在柱头表面正常萌发并形成花粉管穿过柱头,表明其花期杂交与对照相比有明显区别,初步认为对自交不亲和基因SRK的编辑影响了敲除植株的亲和性;敲除植株pCas-tBoCENH3-ABCD/tBoSRKABCD蕾、花期自交与野生型对照的蕾、花期自交相比,敲除植株自交初期柱头正常伸长,但随着时间延长,发育逐渐停止,并出现死胚现象,与cenh3纯合突变体具胚胎致死性的研究结果相一致。2.GFP-tailswap转基因甘蓝植株的获得。构建以Bar基因为筛选标记的pBoCENH3-GFPtailswap互补载体以挽救cenh3的胚胎致死性。利用农杆菌介导法转化甘蓝自交不亲和系9025,获得7株pBoCENH3-GFPtailswap转基因阳性植株。对6个转基因单株的花粉粒及根尖组织进行GFP荧光检测,花粉荧光检测结果发现转基因植株与对照9025相比,花粉壁荧光信号较强,但均在核内无表达。根尖细胞荧光检测结果显示,转基因植株pBoCENH3-GFPtailswap-5,6号的DAPI信号及GFP信号可以在核内共定位,且GFP信号与对照有明显差异,表明GFPtailswap蛋白可加载到有丝分裂动粒上。pBoCENH3-GFPtailswap-5,6号单株可用于互补cenh3突变体植株以获得单倍体诱导系。3.cenh3突变体植株与GFP-tailswap互补植株进行正反交获得后代。以敲除植株pCas-tBoCENH3-ABCD/tBoSRK-ABCD作母本,互补植株pBoCENH3-GFPtailswap作父本进行蕾期杂交,部分杂交组合可以获得种子,但结籽数量明显低于以互补植株pBoCENH3-GFPtailswap作母本、敲除植株pCas-tBoCENH3-ABCD/tBoSRK-ABCD作父本杂交的结籽数量,表明在胚珠中表达的GFPtailswap蛋白有利于改善来自于父本雄性配子的cenh3突变缺陷。