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背景和目的神经退行性疾病(neurodegenerative disease,ND)一直以来就是一个世界性难题,目前尚未有好的治疗方法,而中枢神经系统神经元轴突脱髓鞘产生的信号传导阻滞是导致神经退行性疾病发生的重要因素。少突胶质前体细胞在中枢神经系统中不断增殖、迁移最终分化为少突胶质细胞,是神经元轴突的髓鞘形成细胞的前体细胞。生理状态下,为保证神经元轴突髓鞘完整,神经信号传导顺利,少突胶质前体细胞必须消耗大量ATP不断增殖分化,以确保少突胶质细胞及时替代生理或病理时脱落的髓鞘,因此少突胶质前体细胞的高代谢、高耗氧状态使得细胞内活性氧的浓度较高,极易受到外界氧化攻击。如果少突胶质前体细胞受损,神经元轴突脱落的髓鞘不能得到及时补充,神经传导受阻,很容易诱发神经退行性疾病。因此,避免中枢神经系统少突胶质前体细胞氧化损伤是预防和治疗神经退行性疾病的重要手段。莫诺苷是从山茱萸中提取出来的天然活性小分子物质,已有研究表明它对神经元有抗氧化抗凋亡的保护效果,但是对神经胶质细胞的作用报道甚少,因此,本实验采用Oln-93细胞(大鼠少突胶质前体细胞)作为研究对象,探究莫诺苷对Oln-93细胞氧化应激损伤的保护作用和作用机制,希望为神经退行性疾病的预防和治疗提供新的实验依据和思路。方法1.建立Oln-93细胞氧化应激模型及药物处理:Oln-93细胞被孵育不同浓度的过氧化氢(H2O2),用MTT方法确定细胞的最适损伤浓度和处理时间;不同浓度的莫诺苷(Morroniside)预孵育细胞24h,用合适浓度的H2O2损伤,MTT法确定最适的加药浓度。2.使用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化。3.乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒进行各组细胞毒性检测。4.使用丙二醛(MDA)试剂盒检测各组细胞脂质氧化程度。5.使用活性氧(ROS)检测试剂盒检测各组细胞内ROS释放量。6.应用JC-1荧光探针和荧光显微镜检测各组细胞线粒体膜电位(MMP)变化,观察细胞凋亡情况。7.使用TUNEL试剂盒检测各组细胞TUNEL表达情况。8.使用Hoechst33342活性细胞染色剂对细胞核染色观察各组细胞胞核形态变化。9.提取各组细胞蛋白,进行Western Blot方法检测氧化相关蛋白i NOS、SOD2和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、AKT、P-AKT、Caspase3的表达情况。10.应用AKT通路抑制剂LY294002,检测以上氧化和凋亡指标,进一步探讨莫诺苷的作用机制。结果1.MTT法检测细胞活性,结果显示莫诺苷对H2O2诱导的细胞活性下降有明显的改善作用。2.细胞形态学结果显示莫诺苷能明显改善H2O2损伤Oln-93细胞造成的破碎、皱缩等形态变化。3.LDH细胞毒性检测结果表明,H2O2损伤后细胞释放LDH明显增多,莫诺苷能明显降低细胞LDH的释放。4.脂质氧化检测结果显示,莫诺苷抑制细胞内脂质发生过氧化,显著减少H2O2诱导的MDA产量。5.ROS检测结果表明,莫诺苷能显著降低H2O2诱导的Oln-93细胞的ROS释放量。6.线粒体膜电位检测结果发现,莫诺苷能明显抑制H2O2诱导的线粒体膜电位的降低。7.TUNEL检测结果表明,莫诺苷能明显减少H2O2诱导的TUNEL表达,对细胞凋亡有显著的抑制作用。8.Hoechst33342染色结果表明,H2O2处理使细胞核呈现皱缩、破碎和不规则的凋亡形态,莫诺苷能明显减少发生凋亡的细胞数量。9.Western Blot检测结果表明莫诺苷能显著降低i NOS表达,提高抗氧化蛋白SOD表达,并且能降低促凋亡蛋白Bax、Caspase3表达,提高抗凋亡蛋白Bcl-2和P-AKT表达。10.应用LY294002孵育Oln-93细胞后进行检测,实验结果表明(1)细胞形态学结果显示LY294002预孵育之后莫诺苷对细胞形态的改善作用被抑制;(2)ROS检测结果表明,Oln-93细胞经过LY294002预先孵育之后,莫诺苷对ROS的抑制作用不明显;(3)TUNEL检测结果表明,Oln-93细胞经过LY294002孵育之后,莫诺苷对TUNEL表达的改善作用被抑制;(4)Hoechst33342活细胞染色结果表明,Oln-93细胞被LY294002孵育之后,莫诺苷抗细胞凋亡的作用被抑制。(5)Western Blot检测结果发现LY294002预处理细胞后,莫诺苷调控凋亡蛋白(Bcl-2、P-AKT、Bax、Caspase-3)和i NOS蛋白的能力显著降低。结论莫诺苷可显著抑制H2O2诱导的Oln-93细胞氧化损伤。其机制可能基于PI3K/AKT通路,与抑制细胞内氧化应激和促凋亡分子(Caspase-3)的表达、促进Bcl-2的表达进而阻断线粒体凋亡途径密切相关。