目的:砷是国际癌症研究机构（IARC）确认的Ι类人类致癌物,可引起人类肺癌、皮肤癌、膀胱癌等多器官癌症。由于砷的生物学作用种属间差异较大,目前尚未直接复制出动物致癌模型,其致癌机制的研究多集中在砷诱导的恶性转化细胞。越来越多的研究表明,环境化学物所引起的炎症反应在其所致的细胞恶性转化及致癌过程中发挥重要作用。目前,炎症-癌症的转化机制已成为研究热点。在众多效应机制的研究中发现,长期慢性炎症使得机体防御机能崩溃,可诱发各种类型的肿瘤发生。炎症在肿瘤发生发展的各个阶段都发挥重要作用,它们之间具有较为复杂的关系。砷能够诱导炎症细胞因子的产生,且在砷所致细胞恶性转化中诱导上皮间充质转化（EMT）发生,最终导致细胞恶性转化。活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells,NFAT）最初作为转录因子与活化T细胞IL-2启动子结合而被发现,。研究发现,NFAT家族成员在多种肿瘤细胞中持续活化和/或过表达。NFAT调控的基因在细胞周期进程,细胞发育和分化,肿瘤发生、血管再生和细胞凋亡中发挥重要作用,提示我们NFAT蛋白具有潜在致瘤性。NF-kB是一个重要的调控炎症和肿瘤发生的核转录因子,以同源或异源二聚体形式出现,其中p50/p65是目前最常见且功能最广泛的NF-kB蛋白形式。几乎所有与炎症有关的基因都被活化的NF-kB调控。在多种组织的肿瘤,包括膀胱癌,NF-kB表达水平显著升高,在肿瘤的发生中起了关键作用。NF-kB信号通路影响细胞的生存、增殖、分化和死亡等都多种生物过程。因此,本研究拟建立砷诱导的膀胱上皮细胞恶性转化模型,探讨在细胞恶性转化过程中,促肿瘤发生相关因子和炎症因子的表达水平;NFAT和NF-kB信号通路的活化情况,及二者在促肿瘤发生相关因子和炎症因子的表达中的作用。研究方法:本研究选用人正常膀胱上皮细胞系（SV-HUC-1）,购自美国典型菌种保藏中心（ATCC,编号:CRL-9520）,5%CO₂、37℃常规培养于F12K完全培养基（10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100μg/ml链霉素）中,隔日换液,待细胞生长至85-90%融合后,以0.25%胰蛋白酶消化传代。长期NaAsO₂处理细胞培养,细胞消化传代后,培养于无NaAsO₂的完全培养液中24 h,待细胞完全贴壁,恢复生长状态后,将培养液换成含0.5μmol/L NaAsO₂的完全培养液,继续培养24-48 h。如此反复,长期培养,建立砷诱导的膀胱上皮细胞恶性转化模型,同时设立长期培养对照组。短期砷处理细胞培养:细胞消化传代后,将细胞接种至60 mm培养皿中,待细胞进入对数生长期,以F12K完全培养基配置各染毒浓度（0、1、2、4、8、10μmol/L）NaAsO₂溶液,持续培养24 h。细胞分别使用PDTC（50μmol/L）,CsA（10μmol/L）,U0126（10μmol/L）,SB203580（10μmol/L）,SP600125（10μmol/L）,LiCl（10 mM）预处理30 min后,对细胞进行短期砷处理。采用MTS法检测细胞活力,细胞划痕和transwell迁移实验检测细胞的迁移能力,软琼脂集落形成实验检测细胞恶性程度,平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力。应用Fluo-3,AM染料和流式细胞仪检测细胞内Ca²⁺水平,使用RT-qPCR和Western Blot技术分别检测NFAT2和NF-kB信号通路关键因子mRNA和蛋白表达水平。采用RT-qPCR和Western Blot技术检测促肿瘤发生因子（Bcl2、CCND、PCNA、MMP1）和炎性因子（TNFα、TGFα、TGFβ1、IL8、IL1β）的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,实验结果以均数（x±SD）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）比较各实验组与对照组间的统计学差异,组间比较采用Dunnett’s T3检验。两独立样本间比较采用t检验。以p<0.05为差异有统计学意义。结果:1长期砷处理对细胞活力的影响随着砷处理时间的延长,细胞活力明显增加,砷处理30周、40周后的细胞活力分别是对照组细胞的194%和210%。2细胞划痕、细胞迁移经过长期砷处理的细胞,其划痕愈合能力大大增强,且随着染砷时间的延长,划痕愈合速度明显加快。Transwell实验结果显示长期砷处理的细胞迁移能力明显增强。3软琼脂经过长期砷处理的细胞,能够在软琼脂上形成集落,说明SV-HUC-1细胞经过0.5μmol/LNaAsO₂处理40周发生恶性转化。4长期砷处理对细胞肿瘤发生相关因子mRNA和蛋白表达的影响非砷处理组细胞中Bcl2、CCND、PCNA、MMP1 mRNA和蛋白表达水平没有发生改变;在NaAsO₂处理下,Bcl2、Cyclin D1、PCNA、MMP1 mRNA和蛋白表达水平增强,且随着染毒时间的延长,其表达水平逐渐升高。5长期砷处理对细胞炎症因子mRNA和蛋白表达的影响非砷处理细胞中TNFα、TGFα、TGFβ1、IL8和IL1βmRNA和蛋白表达水平没有发生改变;在NaAsO₂处理下,TNFα、TGFα、TGFβ1、IL8和IL1βmRNA和蛋白表达水平升高,且随着染毒时间的延长,其表达水平逐渐升高。6亚砷酸钠对SV-HUC-1细胞活力的影响各剂量NaAsO₂染毒组细胞活力均降低,且染毒剂量越高细胞活力越低。当染毒浓度达到4μM时,细胞活力已降至80%,当染毒浓度达到10μM时,细胞活力已降至60%。7细胞内Ca²⁺水平检测在8、10μM处理条件下,SV-HUC-1细胞内钙离子水平升高。8短期砷处理对NFAT2 mRNA和蛋白表达水平的影响各处理组中NFAT2的mRNA和蛋白表达水平没有变化,p-NFAT2表达水平降低。在2-10μM处理条件下,核内NFAT2表达增加,4μM处理组表达水平最高。9长期砷处理SV-HUC-1细胞NFAT2表达水平及活化情况非砷处理组细胞中NFAT2 mRNA表达水平没有发生改变;而在0.5μM NaAsO₂处理40周条件下,NFAT2 mRNA表达增加。与mRNA表达相一致,非砷处理组细胞中NFAT2蛋白表达水平没有发生改变;砷处理40周条件后,NFAT2蛋白表达增加。在0.5μM NaAsO₂处理20周条件后,核内NFAT2蛋白表达增加。10 ERK/MAPK参与NFAT2的活化ERK抑制剂（U0126）显着降低NFAT2核蛋白的表达,而用JNK和p38抑制剂处理不能阻断亚砷酸盐诱导的NFAT2核移位。11 GSK3β参与调控NFAT2的活化GSK3β核内表达水平没有发生变化,而p-GSK3β（Ser9）表达水平显著增加,4、8μM处理组高于对照组。GSK3β抑制剂（LiCl）促进NFAT2去磷酸化,活化入核。12 NFAT抑制剂（CsA）对肿瘤发生相关因子蛋白表达的影响NFAT2信号通路抑制后,Bcl2、Cyclin D1、PCNA蛋白表达水平受到抑制。13 NFAT抑制剂（CsA）对炎性因子mRNA和蛋白表达水平的影响NFAT2信号通路抑制剂能够显著抑制砷诱导的细胞炎性因子TNFα、TGFα、TGFβ1、IL8 mRNA和蛋白的表达水平。14砷诱导的恶性转化细胞增殖依赖NFAT2持续活化砷处理40周的细胞能够形成克隆,而NFAT2的抑制剂能够显著抑制转化细胞的克隆形成,抑制转化细胞的体外增殖能力。15短期砷处理对细胞IKKβ/IκBα/NFκB信号通路的影响IKKαmRNA表达水平在8、10μM处理组降低;IKKβmRNA表达水平在2μM处理组升高,而在10μM处理组降低。IKKα蛋白的表达水平在NaAsO2浓度高于8μM时降低。低剂量的NaAsO₂处理（2和4μM）条件下,IKKβ蛋白表达水平增加,并在10μM处下降,与mRNA结果一致。与对照组相比,4μM亚砷酸钠处理后IκBα表达略有下降。在2-10μM处理条件下,p65活化进入细胞核,其核蛋白表达水平显著升高,4μM处理组表达水平最高;在1-4μM处理条件下,p50活化进入细胞核,其核蛋白表达水平显著高于对照组,在4μM处理组表达水平最高。16长期砷处理对SV-HUC-1细胞NFκB信号通路的影响非砷处理组细胞中IKKα、IKKβmRNA和蛋白表达水平没有发生改变;而在0.5μM NaAsO₂长期处理30周条件下,IKKα、IKKβmRNA和蛋白表达水平升高,与对照组相比,30周和40周砷处理的细胞中IKKα和IKKβ蛋白表达水平分别提高了156%和169%,182%和224%。NF-κB p65、p50的核蛋白表达水平在亚砷酸钠长期处理条件下,显著升高,30周和40周砷处理细胞核中表达水平显著高于对照组。17 MAPK参与NFκB信号通路的活化ERK和JNK抑制剂能够阻断p65和p50磷酸化,p50和p65核蛋白的表达水平降低。18 NFκB信号通路对肿瘤发生相关因子蛋白表达的影响NFκB通路活化受阻能够抑制砷诱导的Bcl2、CCND、PCNA蛋白表达。19 NFκB信号通路对炎性因子mRNA和蛋白表达水平的影响NFκB信号通路抑制剂能够显著抑制砷诱导的TNFα、TGFα、TGFβ1、IL8mRNA和蛋白表达。20砷诱导的恶性转化细胞增殖依赖NFκB持续活化NFκB的抑制剂能够显著抑制转化细胞的克隆形成,抑制转化细胞的体外增殖能力。21 NFκB与NFAT2相互作用NF-κB信号通路部分受CaN的调控,抑制NFAT2信号通路活化。结论:1、长期、低剂量砷处理能够诱导人正常膀胱上皮细胞发生恶性转化。2、砷诱导的膀胱上皮细胞恶性转化过程中,肿瘤发生相关因子Bcl2、Cyclin D1、MMP1、PCNA mRNA和蛋白表达水平增高,以及炎性因子TNFα、TGFα、TGFβ1、IL8、IL1βmRNA和蛋白表达水平增高。3、砷处理能够诱导NFAT2活化入核,激活Ca²⁺/NFAT2信号通路。ERK参与NFAT2信号通路的活化;GSK3β负向调控NFAT2信号通路。4、砷处理能够诱导IKKβ/IκBα/NFκB信号通路活化,p65、p50活化进入细胞核;ERK、JNK参与NFκB信号通路的活化;5、NFAT2和NFκB信号通路相互作用促进细胞增殖;和炎症因子TNFα、TGFα、TGFβ1、IL8的表达。