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目的同种异体骨软骨移植是治疗软骨缺损一种有效方法,提高软骨移植物体外保存效果直接影响手术治疗效果。生理状况下力学刺激对软骨功能的维持发挥重要作用。利用模拟人体生理的滚压力学加载装置对体外保存关节软骨施加周期性力学刺激,通过对细胞活力、组织学、力学性能检测来探索滚压力学刺激提升保存效果的可行性,并探索影响软骨组织活力的相关机制。方法1.周期性与非周期性力学刺激对软骨细胞活力的比较以健康猪膝关节组织为实验标本,无菌下在股骨髁关节面利用ARTHREX骨软骨手术器械获取直径约8mm,带有软骨下骨的全长约1.0cm的骨软骨组织,利用自制的滚压力学加载装置,以tsmc加载参数对软骨进行力学刺激。设置周期组与非周期组,每组10例标本。周期组给予软骨每3天刺激1次的滚压力学刺激,随后换液保存,非周期组给予软骨单次滚压力学刺激随后保存,换液频率与周期组相同。在第3、7、14、21天行FDA/EB荧光染色法检测软骨细胞存活率。2.力学刺激对软骨组织保存效果的研究分组为加载组和静态组,每组30个。加载组给予软骨组织每3天刺激1次的周期性滚压力学刺激,然后更换DMEM组织培养液并体外保存;静态组全程在DMEM组织培养液中保存,每3天换液。在第7、14、21、28天检测软骨组织中软骨细胞存活率;在第14、28天行HE染色显示软骨形态学改变,番红O-固绿染色和甲苯胺蓝染色检测软骨蛋白多糖含量,免疫组化染色检测软骨II型胶原含量,力学测试仪检测软骨杨氏模量以评价力学刺激对软骨组织活力影响。Western blot实验检测MEK/ERK通路相关蛋白p-MEK、p-ERK1/2以及凋亡相关蛋白caspase-3、bax的表达,探究相关机理。结果1.周期性与非周期性力学刺激对软骨细胞活力的比较两组的细胞存活率随时间推移而下降。第3天周期组和非周期组的细胞存活率都较高,分别为93.28±0.69%和92.31±0.68%,差异无统计学意义(p>0.05);第7、14天周期组的软骨细胞存活率分别为86.09±0.57%、76.38±0.95%,显著高于非周期组83.30±0.70%、68.53±0.78%(p<0.05);第21天两组的细胞存活率分别为62.51±0.70%和61.47±0.53%,差异无统计学意义(p>0.05)。2.力学加载保存软骨组织效果的研究(1)细胞存活率:第7天、14天加载组软骨细胞存活率分别为87.7±0.8%、78.5±1.3%,显著高于静态组82.6±0.5%、66.4±1.4%,差异有统计学意义(p<0.05);第21天两组细胞存活率分别为62.2±0.8%和60.8±0.7%,第28天两组细胞存活率分别降至62.2±0.8%和60.8±0.7%,差异无统计学意义(p>0.05)。(2)组织学:1)形态学(HE染色):第14天加载组较之静态组有更优异的组织学表现,层次清晰,基质丰富;第28天两组形态学表现较差,基质淡染,软骨与软骨下骨连接疏松。2)蛋白多糖检测:番红O-固绿、甲苯胺蓝染色以及IOD值检测显示,第14天加载组的IOD值分别为223.2±5.9%和174.8±3.2%,显著高于静态组的166.5±3.3%和136.2±2.8%(p<0.05);第28天两组均发生较明显蛋白多糖含量下降,加载组的IOD值分别为132.4±3.1%和94.3±1.4%,静态组的IOD值分别为126.9±2.7%和89.9±2.1%,差异无统计学意义(p>0.05)。3)II型胶原检测:II型胶原免疫组化染色以及IOD值检测显示,第14天加载组的II型胶原IOD值为128.4±2.3%,显著高于静态组的114.3±2.4%(p<0.05);第28天两组均发生较明显II型胶原含量下降,IOD值分别为76.2±2.2%和81.8±1.8%,差异无统计学意义(p>0.05)。(3)生物力学检测:压缩率为15%时,第14天加载组的杨氏模量为8.58±0.23MPa,高于静态组的6.87±0.12MPa,差异有统计学意义(p<0.05);第28天两个组的杨氏模量下降,加载组为6.34±0.10MPa,静态组为6.12±0.08MPa,组间差异无统计学意义(p>0.05)。(4)Western blot实验检测蛋白表达:力学加载2小时后,软骨组织p-MEK与p-ERK蛋白较之静态保存表达增高,caspase-3与bax较之静态保存表达下降,差异有统计学意义(p<0.05)。结论在软骨保存过程中周期性力学刺激优于非周期性力学刺激;周期性滚压力学刺激较之静态保存能在14天时间内提高软骨细胞存活率,维持蛋白多糖与II型胶原含量,增强组织的力学性能,提高软骨保存效果。其作用机制可能是激活了MEK/ERK信号通路,抑制凋亡蛋白表达进而提高细胞活力。力学加载提高软骨保存效果为改进软骨组织库提供一种新思路。