研究目的:听力障碍是目前影响人类健康最为多见的疾病之一。而巨细胞病毒是引发婴幼儿先天性感染极为多见的病原体,同时也是导致人类非遗传性耳聋的主要原因。近年来,迅猛发展的高通量测序技术以及生物信息技术,使非编码RNA的研究更为深入。有研究报道巨细胞病毒感染后会引起非编码RNA表达变化,但缺少对巨细胞病毒感染致聋的过程中非编码RNA差异表达的相关报道。本研究拟通过构建的小鼠巨细胞病毒感染耳蜗感觉上皮细胞模型,用高通量检测技术对其进行全转录组测序,检测巨细胞病毒感染72 h的耳蜗感觉上皮细胞中非编码RNA的表达情况,利用生物信息学技术分析了各种非编码RNA的基本特点,筛选出差异表达的明显的非编码RNA并用qPCR方法进行验证。此项研究将探究出与巨细胞病毒感染耳聋致病相关的差异表达的非编码RNA,为从转录层面及非编码RNA角度进一步研究巨细胞病毒的致聋机制奠定了基础,并为后续进一步研究提供新的方向。研究方法:1.小鼠耳蜗上皮细胞(MCEC)、小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/3T3)的培养。2.小鼠巨细胞病毒毒株(Smith株)的制备和TCID50测定病毒滴度,绘制病毒在小鼠胚胎成纤维细胞的生长曲线。3.构建小鼠巨细胞病毒感染的小鼠耳蜗上皮细胞模型。4.用高通量测序技术进行全转录组测序,检测巨细胞病毒感染与未感染72小时的耳蜗上皮细胞中非编码RNA的表达情况,筛选出差异表达的显著的非编码RNA(miRNA,lncRNA),以及耳聋相关基因。5.对差异表达明显的非编码RNA以及耳聋相关基因用qPCR方法进行验证并进行生物信息学分析。研究结果:1.我们在巨细胞病毒感染与未感染的小鼠耳蜗上皮细胞中,发现了大量差异表达的非编码RNA,包括143个miRNA,其中新发现的有62个;3402个lncRNA,其中新发现的有792个;还发现了5115个差异表达的基因(mRNA)。这些差异表达的非编码RNA在功能上主要涉及离子结合,遗传物质代谢过程的调控,信号转导,细胞过程的调节等,主要参与病毒传染,免疫系统等信号通路。2.我们经过筛选验证得到与测序结果趋势一致的miRNA有10个,其中新发现的有4个;lncRNA有2个,均为已知的;以及2个耳聋相关基因Myo7a、Tmie和以这两个基因为靶基因的3个miRNA。3.利用生信分析及qPCR验证初步得到Myo7a-(miR-1929-5p),Myo7a-(egr-miR-4990),Tmie-(miR-6952-3p)的调控关系对,并预测到1个lncRNA参与Myo7a的ceRNA调控网络,14个lncRNA参与Tmie的ceRNA调控网络。结论:1.在本研究中,证实了在巨细胞病毒感染耳蜗感觉上皮细胞的过程中,确实引起了许多非编码RNA的差异性表达。经测序得到差异表达的miRNA有143个,lncRNA有3402个,他们主要通过行使离子结合,遗传物质代谢过程调控,信号转导等生物学功能,参与免疫系统,病毒传染等信号通路,从而在巨细胞病毒感染致聋的过程中发挥着作用。2.经筛选和验证得到了与巨细胞病毒感染耳聋相关的潜在具有调控功能的非编码RNA,以及耳聋相关基因Myo7a和Tmie。利用生信分析初步验证得到Myo7a-(miR-1929-5p),Myo7a-(egr-miR-4990),Tmie-(miR-6952-3p)的调控关系对,并预测到这两个耳聋基因所参与的ceRNA调控网络,为巨细胞病毒感染导致耳聋的机制研究提供了新的研究切入点。