研究背景和目的X-连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XIAP-associated Factor1, XAF1)是一个肿瘤抑制基因,能够直接与内源性的XIAP结合从而逆转其抗caspase的作用,进而抑制肿瘤细胞的增殖。FHL2(four and a half LIM domain2)是一个胃肠道癌基因,仅含有四个半的LIM结构域,为数个信号传导通路所共有。P-catenin是Wnt通路的关键性分子,能够与E-cadherin在细胞膜形成复合物,对维持细胞间紧密连接具有重要作用。Snail1和ZEB1(zinc finger E-box-binding homeobox1)是E-cadherin的抑制子,同时也是上皮-间充质转变(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的重要转录因子。缺氧诱导因子la (hypoxia induciable factor1alpha, HIF-1α)是细胞适应低氧的重要转录调节因子,可与β-catenin协同促进肝内原位侵袭转移和远处转移,并通过与EMT转录因子(Twist)直接结合促进肿瘤转移。特异性蛋白1(specificity protein1, Spl)是真核细胞转录机制中的重要组分,通过与FHL2启动子序列结合对其发挥转录调控作用。本研究以癌蛋白在大肠癌EMT及侵袭转移过程中的作用及潜在机制为核心,探讨上述八个蛋白在胃肠癌中的作用及内在联系,揭示了大肠癌转移的新的可能机制,为进一步的干预研究提供理论和临床依据。方法1、XAF1与FHL2的相互作用1.1XAF1相互作用蛋白的筛选及鉴定克隆人XAF1基因cDNA序列,构建pGBKT7-XAF1-DBD酵母表达载体,以XAF1为“诱饵蛋白”,筛选人卵巢cDNA文库,利用酵母双杂交系统寻找XAF1的作用蛋白。运用谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白沉淀(GST-pull down)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)和免疫荧光等技术进一步验证FHL2为XAF1的作用蛋白,并寻找其功能结构域。1.2XAF1对FHL2表达及功能的作用分别抽提细胞总蛋白、胞核、胞浆和线粒体成分蛋白,运用western blot、 co-IP和免疫荧光技术检测XAF1对FHL2表达和分布的影响；双荧光素酶报告基因检测系统和western blot方法评价XAF1对FHL2共转录子(β-catenin和AP-1)的活性及下游蛋白(IL-8和p-c-jun)表达的影响。2、FHL2在肠癌EMT及侵袭转移中作用及机制2.1FHL2在原发性肠癌和转移癌组织中的表达运用免疫组织化学方法(immunohistochemistry, IHC)观察17对原发和转移肠癌组织中FHL2的表达和分布,探讨其与肠癌发生发展和侵袭转移的关系。2.2FHL2对肠癌细胞粘附和侵袭转移的作用实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR, qPCR)评价不同粘附能力细胞群中FHL2的表达水平。粘附、侵袭和划痕实验分别评价FHL2对肠癌细胞粘附和侵袭转移能力的作用。2.3FHL2对EMT的作用重组转化生长因子-beta1(Recombinant human transforming growth factor beta1, rTGF-β1)和／或抗TGF-β1抗体处理不同FHL2表达水平的肠癌细胞,RT-PCR、qPCR和western blot评价FHL2对rTGF-β1诱导的EMT的作用。运用siRNA敲低和同义基因过表达以及过表达截短突变蛋白拮抗内源蛋白等方法改变FHL2的表达,观察FHL2单独对EMT标志分子的作用。2.4FHL2促进肠癌EMT的机制Western blot、IHC、双荧光素酶实验等分别探讨FHL2与E-cadherin, FHL2与β-catenin的相关关系；免疫荧光技术观察FHL2对胞膜E-cadherin/β-catenin复合物形成的影响。3、FHL2通过与Snaill结合抑制E-cadherin的转录和表达3.1FHL2与Snaill在肠癌的表达Western blot、免疫荧光双标记和IHC分别检测FHL2与Snail1l在肠癌细胞及临床原发肠癌及转移组织中的表达。3.2FHL2与Snail1的相互作用及功能性结构域的鉴定Co-IP检测内、外源性FHL2和Snail1的作用；并进一步明确FHL2-Snail1结合的结构域。3.3FHL2对Snail1表达及代谢的作用分别抽提细胞总蛋白及胞核、胞浆蛋白,western blot检测FHL2过表达对Snail1总蛋白及磷酸化蛋白表达的作用。3.4FHL2通过结合Snail1对E-cadherin发挥转录调控作用构建不同长度E-cadherin启动子片段(含Snail1结合位点)的野生型及突变型荧光素酶报告基因质粒,评价FHL2对E-cadherin转录活性的影响。联合实验评价Snail1低表达对FHL2过表达抑制E-cadherin启动子转录活性的作用。4、HIF-1α在肠癌EMT及侵袭转移中的作用及机制4.1HIF-1α对细胞形态及EMT标志性分子的作用通过甲磺酸去铁胺(deferoxamine mesylate salt, DFO)刺激诱导,和Ad5-HIF-1α-EGFP病毒感染两种方法获得HIF-1α过表达的细胞。显微镜下观察细胞形态变化以及E-cadherin和Vimentin的分布；并探讨HIF-1α对EMT标志性分子E-cadherin, Plakoglobin, Vimentin和N-cadherin的作用。4.2体外HIF-1α对肠癌细胞粘附、侵袭和转移能力的影响DFO (100μM)或Ad5-HIF-1α-EGFP (MOI=100)感染细胞后,分别运用粘附、侵袭和划痕实验检测HIF-1α对肠癌细胞粘附、侵袭转移能力的作用。4.3体内HIF-1α对肠癌细胞侵袭侵袭能力的影响构建腺病毒重组质粒pDC316-HIF-1α-EGFP。采用AdMax腺病毒包装系统进行包装并获得高滴度浓缩液。将Ad5-HIF-1α-EGFP和Ad5-EGFP分别感染的HT29单细胞悬液(1.2X106／只)脾被膜下注射于5-6周龄BALB/c雌性裸鼠。36天后处死、解剖,首先肉眼观察有无脾脏原位瘤的发生；是否存在肝、肺、肾等脏器转移。取肝脾保存,后续H&E, IHC及其他实验待用。4.4HIF-1α促进肠癌EMT的机制QPCR和IHC检测HIF-1α和ZEB1在同一病人癌旁正常粘膜和肠癌组织的表达情况；IHC观察HIF-1α ZEB1、E-cadherin和Vimentin在22对同一病人的原发肠癌和淋巴结转移组织中的表达；qPCR和western blot观察DFO或腺病毒感染对ZEB1的作用；生物信息学分析ZEBl启动子上游3500nt内(定义翻译起始密码子ATG为0)潜在的HIF-1α结合位点(hypoxia response element, HRE);电泳迁移率变动分析(Electrophoresis Mobility Shift Assay, EMS A)检测核蛋白与探针的结合反应,寻找HIF-1α与ZEB1直接结合的证据。5、Spl在肠癌干细胞(cancer stem cells, CSCs)中的作用5.1肠癌CSCs的分离、纯化和培养运用Ficoll-Paque密度梯度法,收集Ficoll-Paque和培养基中间层细胞,即CSCs。培养条件如下：含10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(recombinant human fibroblast growth factor-basic, FGF-2),20ng/ml重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor, EGF),0.2%N-2Plus media Supplement,100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素的Dulbecco’s Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F12,(DMEM/F12)培养基；低粘附能力培养皿；37℃、5%CO2、98%-100%湿度常规培养。5.2CSCs特性、EMT及干细胞表面标志分子的鉴定显微镜下观察干细胞球的形成；流式细胞分析技术评价静止期干细胞的比例；Ki-67免疫染色观察增殖速度；qPCR检测Snai、E-cadherin、Vimentin、 CD117(c-Kit)在CSCs和对照细胞中的表达；qPCR和流式细胞技术检测CD133> CD44和CD166的表达。5.3Sp1在肠癌组织及CSCs中的表达IHC观察45对肠癌组织和癌旁肠粘膜Spl的表达情况。qPCR和western blot检测Spl在肠癌CSCs及对照中的表达。5.4Sp1对CSCs生长,克隆形成及凋亡的影响转染Sp1siRNA/Ctrl siRNA,或500nM光辉霉素(Mithramycin A, MIA)/PBS处理分别至CSCs。显微镜下计数不同时间点活细胞数,评价Spl低表达对CSCs生长的作用；soft-agar实验评价Spl对细胞克隆球形成能力的作用；流式细胞技术评估抑制Spl表达对CSCs凋亡的影响。5.5体内、体外Spl低表达对CD44和CD166表达的作用5-6周龄雌性BALB/c裸鼠皮下接种SW480或HCT116单细胞悬液,瘤体可触时,腹腔注射MIA或PBS,每3天一次,连续3周,并测量瘤体体积。3周后处死并取出瘤体,胶原酶消化,对单细胞悬液进行流式细胞技术检测,评价Spl低表达对CD44和CD166表达的影响。转染Sp1siRNA/Ctrl siRNA到CSCs,或进行MIA处理。qPCR和流式细胞技术检测CD44和CD166的表达。6、数据的统计学处理IHC每张切片随机选取3-5个不同视野,计算目的蛋白阳性细胞表达率,并进行两个样本的配对t检验；qPCR,细胞粘附、侵袭、生长、克隆形成以及双荧光素酶报告基因检测结果先进行方差齐性检验,方差齐(P>0.05)则进行两个处理组间独立样本t检验或多个处理组间one way ANOVA统计分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用LSD法；方差不齐(P<0.05)则应用Satterthwaite近似t检验或Welch检验分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用Dunnett’s T3检验。应用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有数据采用均数±标准差(x±SD)表示,P<0.05具有显著性差异。结果1、XAFl能够与FHL2结合并消减其表达和功能1.1XAF1作用蛋白的筛选及鉴定以XAF1为“诱饵蛋白”,筛选人卵巢cDNA文库,挑出22个阳性克隆抽提酵母质粒进行测序分析鉴定,经NCBI Genebank数据库BLAST比对证实,其中两个克隆为FHL2基因部分片段(包含598个碱基)。GST-pull down、co-IP和免疫荧光共定位等技术证实FHL2为XAF1结合蛋白。1.2FHL2与XAF1作用结构域的鉴定FHL2的第二个LIM结构域(LIM2)介导FHL2-XAF1结合过程,并起负性调控作用；LIM3和LIM4参与上述作用；而XAF1的N端锌指结构和C端非锌指结构均能够结合FHL2。1.3XAF1对FHL2表达及分布的作用FHL2和XAF1在细胞核、线粒体和细胞浆均有表达,且两蛋白在上述三部位均有相互作用；XAF1负性调控FHL2总蛋白的表达,降低FHL2在细胞核和浆的表达水平,但增加线粒体的FHL2表达水平。1.4XAF1对FHL2相关转录因子活性作用的检测XAF1过表达显著抑制pTOPFLASH转录活性,其相对荧光值在AGS-vector细胞为476.85±30.65,而在AGS-XAF1为267.20±0.48(P=0.000)。相反,抑制XAF1表达增加pTOPFLASH转录活性,其相对荧光值在ctrl siRNA组为309.67±31.94,而在XAF1siRNA组为752.13±108.97(P=0.003)；同理,XAF1过表达抑制、而XAF1siRNA增加Luc/AP1的转录活性。在AGS/vector为122.21±3.31,而在AGS/XAF1为71.06±6.92(P=0.000)；相反,ctrl siRNA组为110.30±30.36,而XAF1siRNA组为250.07±33.94(P=0.006)。Western blot结果显示XAF1同样负性调控TCF/β-catenin的下游基因IL-8以及p-c-jun的蛋白表达。2、FHL2通过调控E-cadherin/p-catenin复合物的形成促进肠癌的EMT及侵袭转移2.1FHL2在原发肠癌及转移癌中高表达FHL2在肿瘤组织中的表达明显高于邻近正常肠粘膜,上皮性肿瘤细胞占主导,且胞核、胞浆均有表达,而癌周正常组织间质无表达；FHL2在转移癌也呈强阳性表达,阳性率与原发灶相当(P=0.365)。FHL2还能够穿透基底膜进入基底膜下的间质区域,提示FHL2与肠癌的侵袭转移有关。2.2FHL2对肠癌细胞粘附、侵袭转移能力的影响高粘附能力细胞中FHL2的表达高于低粘附能力细胞；siRNA压低FHL2表达后细胞的黏附能力降低；侵袭和划痕实验表明FHL2表达水平与肠癌细胞的侵袭转移能力呈正相关关系。2.3FHL2与rTGF-β1及rTGF-β1诱导的EMT的关系rTGF-β1能够以剂量依赖方式刺激FHL2的表达,降低E-cadherin而增加Vimentin的表达；TGF-β1中和抗体不仅抑制内源性FHL2的表达,而且可以阻断外源性rTGF-β1引起的FHL2表达；FHL2siRNA阻断了rTGF-β1引起的Vimentin表达,而增加E-cadherin表达。在FHL2过表达细胞中,抑制Smad2/3或Smad4的表达对E-cadherin和Vimentin表达水平无影响。2.4FHL2对多个EMT标志性分子的作用FHL2与E-cadherin呈负相关关系；与Vimentin、MMP-9、Snail和Twist呈正相关关系。2.5FHL2与E-cadherin呈负相关关系FHL2在肠癌组织表达水平显著高于邻近正常肠粘膜；而E-cadherin在癌旁正常组织高于肠癌组织。细胞模型上,FHL2阴性调控E-cadherin的表达。2.6FHL2与β-catenin呈正相关关系FHL2表达的变化对β-catenin总蛋白的表达无明显影响,而磷酸化P-catenin与FHL2呈反向关系；FHL2高表达降低细胞浆和核的磷酸化β-catenin; FHL2正向调控β-catenin的转录活性,DLD1-pcDNA3.1中pTOPFLASH/pFOPFLASH比值为15.10±1.75,而DLD1-FHL2-pcDNA3.1中增加到30.10±4.47(P=0.006)。相反,上述比值在SW480FHL2siRNA中为1.47±0.65,而在对照细胞为21.82±11.31(P=0.036)。此外,压低FHL2表达能够降低β-catenin下游靶基因——Survivin和CyclinD1的核酸和蛋白表达水平。2.7FHL2对E-cadherin/β-catenin复合物形成的影响siRNA压低FHL2表达后,E-cadherin和β-catenin由胞核分布为主转为胞膜分布为主；而高表达FHL2导致膜相关性E-cadherin和β-catenin减少,核蛋白表达增加。3、FHL2通过与Snail1结合抑制E-cadherin的转录和表达3.1FHL2和Snail1在肠癌的表达及分布FHL2在SW480,HCT15和SW1116中高表达,Snai1在上述三株细胞系表达水平也较高；FHL2在DLD1和HT29中表达相对较低,同样,Snail在该两株细胞也呈低表达甚至不表达。荧光显微镜下观察发现FHL2和Snail在细胞浆和核均有分布,且都以核为主。FHL2和Snail1在临床组织中表达谱亦相似,在原发肠癌和转移癌中均呈强阳性表达,而邻近正常组织表达较低,且具有显著性统计学差异(P<0.05)。3.2FHL2能够与Snail1结合Co-IP发现FHL2能够与Snail1结合,且只有表达FHL2完整蛋白的细胞沉淀物中能够检测到Snail1,而任何LIM结构域的缺失均不能,提示FHL2基因的完整性为FHL2-Snail1相互作用所必需。3.3FHL2对Snail1总蛋白及磷酸化蛋白表达的作用首先验证了FHL2对E-cadherin的负性调控作用,并发现FHL2高表达增加Snail1总蛋白而降低磷酸化Snail表达,同时Snail1负性调控E-cadherin。3.4FHL2通过结合Snail1对E-cadherin发挥转录抑制作用Western blot和双荧光素酶报告系统发现：抑制FHL2表达能够降低Snail蛋白的表达水平,同时增加E-cadherin的表达及转录活性。FHL2过表达抑制E-cadherin转录活性,pLuc232在对照细胞中RLU值为176.03±26.15,而在DLD1-FHL2-pcDNA3.1降低为100.40±7.47(P=0.009)；同样,pLuc601在对照细胞为102.65±10.27,而在DLD1-FHL2-pcDNA3.1降低为68.08±7.93(P=0.010)。pLuc232-wt在对照siRNA及FHL2siRNA处理组相对荧光值为76.36±18.32和147.61±16.63(P=0.033)；pLuc601-wt责分别为61.80±12.99和84.30±8.90(P=0.018)。将Snail与E-cadherin结合元件E-box定点突变能够增加E-cadherin转录活性,且该作用在pLuc232较为显著,pLuc232-wt组为76.36±18.32,而pLuc232-mt组为128.84±6.92(P=0.033)。最后,联合实验发现：抑制Snail表达后,pLuc232-mt/pLuc232-wt比值增加,且FHL2能够放大上述E-box突变对E-cadherin转录活性的增加作用。4. HIF-1α通过调控ZEB1促进肠癌EMT及侵袭转移能力4.1HIF-1α对细胞形态及EMT标志性分子表达的作用DFO及Ad5-HIF-1α-EGFP处理细胞后,HIF-1α mRNA和蛋白表达水平显著增加,并引起细胞发生明显的形态学变化。对照细胞呈圆形、椭圆形等多种上皮细胞样形态,且细胞间连接紧密,细胞极性良好；而DFO诱导、HIF-1α过表达的细胞呈梭形、成纤维细胞状,同时细胞间隙增宽。缺氧或HIF-1α能够抑制E-cadherin和Plakoglobin、促进Vimentin和N-cadherin的表达;E-cadherin主要分布在未处理细胞的胞膜,尤其细胞连接处；而DFO处理诱导E-cadherin由胞膜向胞浆和核内移位,同时增加Vimentin的表达水平。4.2体外HIF-1α对肠癌细胞粘附、侵袭转移能力的影响HIF-1α在高粘附能力细胞中的表达显著高于低粘附能力细胞(P<0.05)；DFO处理和腺病毒感染能够显著增加肠癌细胞的粘附、侵袭和转移能力。4.3体内HIF-1α对肠癌细胞侵袭侵袭能力的影响肠癌裸鼠体内转移实验发现,接种腺病毒感染的HT29细胞后,裸鼠饮食和精神状态等一般情况无明显改变。解剖后肉眼发现20只裸鼠均无脾脏原位瘤的发生,亦无肺、肾等脏器转移。HT29-Ad5-EGFP组有1只形成肝内转移灶(1/8)、2只大面积、甚至整个肝脏发生明显斑点状缺血、坏死(2/8)；HT29-Ad5-HIF-1α-EGFP组3只肝脏缺血坏死(3/12)；8只形成肝内转移灶(8/12),且转移结节数目明显多于对照组；上述发生肝缺血坏死的裸鼠其脾脏明显充血,体积较大。4.4HIF-1α和ZEB1在肠癌组织的表达HIF-1α和ZEB1在肠癌组织中表达水平均显著高于邻近正常肠组织,且主要分布在癌细胞胞核,胞浆亦有少量分布。qPCR显示类似的结果。4.5HIF-1α正性调控ZEB1的表达ZEB1的表达水平随HIF-1α的升高而升高。4.6HIF-1α蛋白通过HRE3序列结合ZEB1启动子生物信息学分析发现：在ZEB1启动子3500nt内(定义翻译起始密码子ATG为0,转录起始位点TSS距ATG为22nt)存在4处HRE位点：分别位于-517～-521bp (HRE1),-525～-529bp (HRE2),-630～-634bp (HRE3)和-1342～-1347bp (HRE4). EMSA结果发现：未加核蛋白组无条带出现；HIF-1α过表达+野生型探针组均有结合条带出现,突变上述4个核心序列后,仅在包含HRE3突变序列探针组条带消失。4.7HIF-1α, ZEB1, E-cadherin和Vimentin在原发肠癌和转移组织中的表达HIF-1α和ZEB1在原发肠癌和转移淋巴结呈阳性表达,且主要分布在肠癌细胞核和浆；Vimentin主要分布在原发肠癌和转移淋巴结的间质。E-cadherin在肠癌细胞膜、浆和核均有分布,胞膜尤甚,而在淋巴结几乎无表达。HIF-1α、ZEB1和Vimentin在转移组织中的表达高于原发肠癌组织,其中HIF-α和ZEB1具有显著性差异(P<0.05)；而Vimentin无显著性差异(P=0.203)。E-cadherin在转移淋巴结组织中的表达显著低于原发肠癌组织(P=0.000)。5、Spl在肠癌CSCs中的作用5.1肠癌CSCs的分离及鉴定Ficoll-Paque密度梯度法能够成功分离出具有典型CSCs特性的细胞球,为悬浮、圆或不规则圆形,边界清晰；处于静止期的细胞比例较对照组明显增加(34.88%vs7.11%)。在SW480细胞,Ki67+细胞比例为87.06%,而在SW480-CSCs为12.29%(P=0.000)；同样,HCT116和HCT116-CSCs分别为94%和9.9%(P=0.000),提示CSCs增殖较慢。5.2肠癌CSCs获得EMT特性Snail和Vimentin在肠癌CSCs的表达水平显著高于对照细胞(P<0.05)；c-kit在SW480或HCT116表达水平很低,甚至检测不出,而在CSCs中表达显著增加(P<0.05)；E-cadherin在CSCs的表达水平显著低于对照细胞(P<0.05)。5.3肠癌CSCs表面标志分子的表达CD44在SW480, DLD1, HCT116, HT-29, HCT15, LoVo和SW1116细胞均有表达；CD166表达谱与CD44类似(LoVo细胞除外)；然而,CD133在上述7个细胞系中表达水平均较低,甚至无表达；CD133、CD44和CD166在SW480及HCT116来源的CSCs中表达均较对照细胞显著增加(P<0.05),但CD44和CD166的表达比CD133更具有代表性。流式细胞技术显示：SW480-CSCs中CD44+CD166+细胞比例为25.89%,对照细胞为6.55%；HCT116-CSCs中CD44+CD166+细胞比例为18.63%,而对照细胞为4.56%。5.4Spl在肠癌组织及肠癌CSCs中的表达Spl阳性染色定位于肠癌细胞胞核；癌旁肠粘膜表达水平较低,甚至无表达；在邻近正常肠粘膜,57.8%的细胞为Sp1阴性表达,仅5.9%为Sp1强阳性表达；而在肠癌组织,Spl阴性细胞占25.2%,阳性细胞达74.8%(10.4%：+；34.1%：++；30.3%：+++)；Spl在CSCs中的：mRNA和蛋白水平均显著高于对照细胞；Spl在正常肠粘膜、肠癌及肠癌CSCs中的表达呈递增趋势。5.5Sp1对CSCs生长,克隆形成及凋亡的影响Sp1siRNA和MIA抑制Spl表达后显著阻碍CSCs的生长(27%vs79.95%和14.41%vs78.42%)。与ctrl siRNA组相比,转染Sp1siRNA组细胞克隆数减少约91.7%(P=0.000)；类似地,MIA处理后,细胞克隆数被抑制到4.65%(P=0.000). Ctrl siRNA组发生凋亡的细胞比例为8.75%,而Sp1siRNA组增加为52.69%；同样,PBS组为4.89%,而MIA处理组增加为55.59%。5.6体内Sp1低表达对裸鼠皮下成瘤及CD44和CD166表达的影响SW480成瘤组,PBS注射组CD44+CD166+细胞比例为18.02%,而MIA处理后减少至2.14%；HCT116成瘤对照组CD44+CD166+细胞占23.6%,而MIA处理后降低为2.9%。HCT116成瘤组,MIA对CD44+细胞由7.53%抑制为1.11%；而对CD166+细胞仅由18.03%降为16.18%。5.7体外Spl低表达对CD44和CD166表达的影响随着Sp1表达的降低,CD44和CD166表达亦显著降低(P<0.05)；另一方面,随MIA剂量的增加,CD44和CD166表达量递减。流式细胞技术结果显示：Sp1siRNA转染组CD44+CD166+细胞比例由对照组的32.05%降低为6.77%；MIA组由20.08%降为0.93%。结论1、FHL2是一个XAF1结合蛋白；XAF1负性调控FHL2的活性和表达。2、FHL2通过调控E-cadherin/p-catenin复合物的形成促进肠癌的EMT及侵袭转移。3、FHL2通过与Snail1结合抑制E-cadherin的转录和表达。4、HIF-1a通过调控ZEB1促进肠癌EMT及侵袭转移的能力。5、抑制Spl的表达削弱了肠癌CSCs特性。6、XAF1和E-cadherin在胃肠癌扮演抑癌基因角色,而FHL2、β-catenin、Snail1、 HIF-1α和ZEBl为癌基因,在大肠癌EMT及侵袭转移中具有重要意义。本研究揭示了大肠癌转移的新的可能机制,为进一步的干预研究提供理论和临床依据本研究的创新之处1、利用酵母双杂交系统、GST-pull down、 co-IP和免疫荧光共定位等方法,筛选并鉴定出FHL2为XAF1的作用蛋白,为研究胃肠癌发生发展的信号通路机制提供新思路。2、首次报道抑癌基因(XAFl)与癌基因(FHL2)在胃癌中的相互作用。3、首次揭示FHL2在肠癌EMT及侵袭转移中的作用,并探讨了其分子机制。4、首次探讨FHL2与Snail1的关系。5、首次研究HIF-1α与ZEB1的相互作用。6、首次探讨Spl在肠癌CSCs中的作用。