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小菜蛾(Plutella xylostella L.)属于世界性十字花科害虫,由于其食性广泛、世代周期短等特点,给农作物生产带来了极大的损失,长期以来化学药物滥用使小菜蛾产生了严重的抗药性,同时增加了防治的难度。为了有效防治小菜蛾并为防治其他害虫提供新思路,本实验室测定了小菜蛾的转录组和虫生真菌侵染小菜蛾后不同时间的表达谱数据。本论文以此数据为基础,从中筛选出模式识别家族中革兰氏阴性菌结合蛋白PxGNBP3,并以PxGNBP3为研究对象,对其时空表达模式、微生物诱导动力学和功能进行详细的研究。结果如下:1.根据小菜蛾数据筛选获得的Unigene片段,利用RT-PCR结合RACE技术获得了小菜蛾GNBP3基因,命名为PxGNBP3(GenBank:MH319939)。PxGNBP3基因全长cDNA序列1510bp,开放阅读框为1299bp,编码433个氨基酸残基。蛋白分子质量为48.3kDa,等电点为5.79。PxGNBP3基因序列中含有β-1,3-葡聚糖识别位点、N-端糖类结合域、糖基水解酶区域以及层粘连G蛋白区域。系统进化树分析以及序列比对结果显示小菜蛾PxGNBP3与其他物种的GNBPs基因有较高的同源性。2.为了进一步明确小菜蛾PxGNBP3基因时空表达模式和对微生物的敏感性,RT-qPCR检测小菜蛾PxGNBP3基因在整个发育历期(卵,幼虫,预蛹,蛹和成虫)和幼虫期表达水平分析。结果表明PxGNBP3基因在不同发育阶段均有表达,其中蛹期表达量最高,PxGNBP3在蛹期的表达量是卵期表达量的11.6倍;PxGNBP3基因在整个幼虫期均有表达,但是在蜕皮期间下调表达;组织表达差异性检测结果表明PxGNBP3基因在不同组织中都有表达,中肠表达量最高,体壁次之。利用革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌对小菜蛾4龄幼虫进行处理,RT-qPCR结果表明PxGNBP3基因可以被三种类型微生物诱导表达,其中PxGNBP3基因被虫生真菌强烈诱导表达,白僵菌诱导表达效果较好。苏云金芽孢杆菌在6h诱导PxGNBP3高表达,金黄色葡萄球菌在48h诱导PxGNBP3基因高表达;粘质沙雷氏菌和大肠杆菌均在18h诱导PxGNBP3基因大量表达。3.为了研究PxGNBP3基因的功能,本论文利用两种RNAi方法处理小菜蛾:(1)体外显微注射dsRNA到小菜蛾到体内,RT-qPCR检测PxGNBP3基因表达水平,RNA干扰36h后PxGNBP3基因被抑制表达。(2)构建PxGNBP3的干扰载体pSilent-dsPxGNBP3并转染白僵菌原生质体,获得重组白僵菌,通过体壁侵染法处理小菜蛾。重组白僵菌侵染小菜蛾不同时间点解剖小菜蛾中肠,体壁和脂肪体三个组织,利用RT-qPCR检测PxGNBP3在这三个组织中的动态表达量。结果表明,重组白僵菌侵染后,PxGNBP3基因在三个组织都被抑制表达。其中,中肠中表达量最高下调90%,最低下调24%;PxGNBP3基因在脂肪体中最高被下调94%,最低下调43%;PxGNBP3基因在体壁中最高下调85%,最低下调56%。进一步对Toll信号通路中的关键配基Sp?tzle进行检测,RT-qPCR结果表明Sp?tzle基因在脂肪体和体壁中始终被抑制表达,Sp?tzle基因在中肠中同样被抑制表达,但36h Sp?tzle基因表达水平高于对照。对其终端效应因子抗菌肽基因(Cecropin1,Cecropin2,Cecropin3,Lysozyme1,Lysozyme2,Moricin)进行了RT-qPCR检测。检测结果表明六种抗菌肽基因在小菜蛾体壁和脂肪体中表达模式基本一致;在12-24h处于被抑制表达状态,而36h或48h某些抗菌肽基因高表达,而中肠中抗菌肽的表达没有规律性。4、为了获得重组蛋白及其多克隆抗体,本论文构建原核表达载体pGEX-4T-PxGNBP3,在宿主菌株BL21中进行表达。SDS-PAGE电泳检测PxGNBP3蛋白在IPTG诱导下获得大量表达,蛋白分子量为55kDa。利用带纯化标签GST树脂对融合蛋白GST-PxGNBP3进行纯化,制得纯化重组蛋白rPxGNBP3,免疫新西兰大白兔获得效价为1:512,000,多克隆抗体anti-PxGNBP3能够特异性识别目的蛋白。5、为了进一步从蛋白水平研究PxGNBP3蛋白的功能,将纯化后的重组蛋白rPxGNBP3与微生物进行孵育,电子显微镜下检测发现重组蛋白rPxGNBP3对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌以及真菌均有凝集作用,当在钙离子存在的条件下,凝集效果增强。将不同细胞壁成分(PGN,LTA,LPS)与虫生真菌侵染小菜蛾后的血浆进行温育,结果显示这些细胞壁成分能强烈提高PO的活力,LTA对PO活性影响最大。当将多克隆抗体anti-PxGNBP3加入到血浆中,PO活力降低,说明多克隆抗体anti-PxGNBP3可以抑制血浆中的蛋白,从而进一步降低PxGNBP3对真菌细胞壁的识别。6、小菜蛾血细胞包囊作用的研究表明,向血细胞中加入SephadexA-25琼脂糖凝胶珠后,光学显微镜进行检测,结果表明血细胞可以很快在凝胶珠表面聚集,形成一层或多层的鞘状物质将凝胶珠包囊起来。混合液中添加纯化蛋白rPxGNBP3孵育后,包囊效果更加明显,说明蛋白rPxGNBP3可以加强血细胞的包囊作用。本论文利用从虫生真菌侵染小菜蛾后测定的DGE中筛选出模式识别受体PxGNBP3,分别从mRNA和蛋白水平对其功能进行详细的研究,研究结果为新型真菌杀虫剂提供新的思路和方法。