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自1982年第一头牛体外受精后代出生以来,虽然国内外学者对牛的体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术进行了不断的完善,但是目前对于一些因素对IVF效率的影响还存争议。因此,有必要对牛的IVF体系进行优化研究。这不仅有助于进一步明确这些因素对IVF的影响,而且对于提高IVF胚胎生产效率及加速IVF技术在生产上的推广应用都有重要的意义。本研究在目前国内外体外受精研究的基础上,对牛卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)、IVF及早期胚胎的体外培养(in vitro culture,IVC)作了进一步的优化研究,并重点研究了葡萄糖对牛IVF及早期胚胎体外培养的影响。旨在建立一套经过优化的牛IVF技术体系。1.在卵母细胞体外培养中,比较了不同蛋白质添加物(胎牛血清,fetal bovine serum,FBS;新生牛血清,newborn calf serum,NCS;牛血清白蛋白,bovine serum albumin,BSA)以及表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对卵母细胞IVM的影响。结果表明,与BSA相比,血清可以显著促进卵母细胞的成熟,而FBS对成熟效果要好于NCS。EGF添加量在20 ng/mL时即明显促进卵母细胞的成熟率,随着其浓度的增加,卵母细胞成熟率并未相应增加。2.在精子获能和受精中,不同公牛个体对体外受精卵裂率、8-细胞胚胎发育率及囊胚率均有明显影响,就体外受精卵裂率来讲,2号牛(62.3%)和3号牛(67.4%)显著高于5号牛(35.8%, P<0.01)。精子获能液中肝素的添加剂量对体外受精的影响仅表现在卵裂率的差异,50 ng/mL组的卵裂率(71.3%)显著高于10 ng/mL组(62.1%, P<0.05)。就卵裂率及囊胚率来讲,获能液和受精液中的葡萄糖添加与否对IVF无明显影响。3.受精卵体外培养时,无论在开始进行胚胎培养时就加入葡萄糖,还是先在不含葡萄糖的培养液中培养48 h后添加葡萄糖,5.6 mmol/L组的囊胚发育率均明显低于其他各组。这表明,在体外高浓度的葡萄糖会抑制牛IVF胚胎的体外发育。在培养开始时即加入3.0 mmol/L葡萄糖时,其8-细胞胚胎发育率低于不添加葡萄糖组(50.9% vs 60.6%, P<0.05);而在培养48 h后加入3.0 mmol/L葡萄糖时,其8-细胞胚胎与不添加葡萄糖组无明显差异(59.8%, 59.3%, P>0.05),这提示葡萄糖对胚胎发育的影响与其添加时期有关。在以FBS为蛋白质添加物时,添加1.5 mmol/L葡萄糖与否并未显著影响IVF胚胎的囊胚发育率;而在以BSA为蛋白质添加物时,添加1.5 mmol/L葡萄糖却明显促进了IVF胚胎的囊胚发育率(23.1% vs. 17.3%, P<0.05)。这说明葡萄糖对IVF胚胎体外发育的影响还与蛋白质添加物有关。另外,在培养液中添加1.5 mmol/L葡萄糖时,以FBS为蛋白质添加物组的囊胚发育率显著高于以BSA作为蛋白质添加物组(37.8% vs 23.1%,P<0.05)。这进一步说明FBS可以提高牛IVF体系的胚胎生产效率,在牛IVF体系中具有重要作用。