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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)为格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)的病原,为定殖于健康猪上呼吸道的条件致病菌,在某些条件下能够侵入机体并引发猪的多发性、系统性疾病。热应激需求蛋白(high temperature requirement A)Htr A家族是一类在单细胞和多细胞生物中高度保守的蛋白酶,在蛋白质质量控制过程中极为重要。在许多病原菌当中,htr A编码的热应激需求蛋白与其自身生存及毒力密切相关。本课题主要研究了副猪嗜血杆菌中Htr A对于其在应激条件下的自身存活及对宿主细胞粘附能力的影响,取得的主要结果如下:1.Nagasaki-Δhtr A缺失株的构建及鉴定构建重组质粒p K18mobsac B-htr A-UKD自然转化至副猪嗜血杆菌血清5型参考菌株Nagasaki中,并以kan抗性筛选得到htr A缺失突变株Nagasaki-Δhtr A。通过PCR、RT-PCR、Southern blot等鉴定方法,证明htr A基因缺失株构建成功。2.Nagasaki野生株与Nagasaki-Δhtr A缺失株环境适应性比较将Nagasaki与Nagasaki-Δhtr A分别在37℃及40℃培养并绘制生长曲线,结果表明在37℃及40℃条件下缺失菌株的生长曲线受到不同程度的影响,且40℃时缺失菌株的生长显著减缓,活菌数降低。在p H6.5及p H8.5的条件下培养并绘制生长曲线,结果表明偏酸性条件下两株菌的生长曲线均受到显著影响,而在偏碱性条件下两株菌的生长曲线受影响程度较小,对数期时同一时间点时缺失株的OD600值低于野生株,证明缺失株环境适应性较野生株弱。扫描电镜观察结果发现缺失株的菌体表面较野生株光滑。3.副猪嗜血杆菌中Htr A与菌株的抗吞噬及粘附能力、血清抗性相关与猪肺泡巨噬细胞(3D4/2)互作后显示Nagasaki-Δhtr A抗吞噬能力显著高于野生菌株。与猪肾上皮细胞(PK-15)及猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)互作后显示Nagasaki-Δhtr A的粘附指数在0.5h、1.5h、2.5h三个时间点时显著低于Nagasaki野生株。加入原核表达的Htr A后Nagasaki野生株对猪肾上细胞(PK-15)的粘附能力显著增强。血清抗性试验结果表明,在缺失htr A基因之后Nagasaki的血清抗性显著提高。4.荧光定量实验筛选存活、粘附相关差异表达基因选出副猪嗜血杆菌与细菌粘附侵入、热休克、血清抗性有关的基因进行相对荧光定量实验,在37℃条件下,htr A基因的缺失会显著下调rfa E、thy A、cdt B、nan H、rfa F基因的表达,这些基因与副猪嗜血杆菌的粘附定殖能力相关,和之前粘附能力显著下降的表型一致。而较显著上调表达的有ops X基因和clp P基因,分别与血清抗性及热休克相关;40℃时htr A基因的缺失所下调表达的基因也主要是与粘附相关,另外两个热休克相关基因deg S、clp P也下调表达。证明htr A的缺失影响到了重要相关功能基因的表达。综上,本研究发现热应激需求蛋白Htr A与副猪嗜血杆菌应激耐受、粘附能力、抗吞噬、血清抗性等相关。