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目的: 为了探究环烯蒾萜类化合物当药苷的保肝作用,利用四氯化碳诱导的急性肝损伤模型,评价当药苷给药不同浓度不同给药周期的药效;利用四氯化碳诱导的肝纤维化模型探讨当药苷对肝纤维化的保护作用及其抗纤维化作用的分子机制,为临床抗纤维化治疗提供依据,为药物开发奠定基础。 方法: 1.利用血清肝损伤方面生化指标以及肝脏H&E染色病理切片,评价不同浓度的当药苷对急性肝损伤的保护作用。 2.通过天狼星红染色的病理切片以及小鼠羟脯氨酸ELISA试剂盒对小鼠肝脏中羟脯氨酸的测定,探讨当药苷抗纤维化作用的药效。 3.通过肝脏的α-SMA免疫组化分析,探讨当药苷作用后对肝纤维化过程中肝星状细胞活化的影响。 4.为了探究当药苷抑制肝星状细胞增殖活性,通过细胞计数对不同给药周期的细胞数进行测定;通过平板克隆实验对当药苷抑制肝星状细胞增殖进行定性评价。 5.RT-PCR、Western Blot以及人collagenⅠ ELISA试剂盒体内体外分别探讨当药苷给药后对肝中fxr、miR-29a以及肝纤维化指标col1a1、timp1的影响。 6.通过体外转染siFXR以及miR-29a抑制剂,探讨当药苷是否是通过FXR/miR-29a发挥其抗纤维化作用机制。 结果: 1.血清生化指标ALT、AST、TBA、ALP以及H&E染色的病理切片结果显示,当药苷能够有效地抑制四氯化碳引起的肝损伤,减少四氯化碳所引起的肝脏病理切片中炎性细胞浸润,125 mg/kg剂量的药效最好,因此抗纤维化作用研究利用此给药剂量。 2.天狼星红染色的病理切片显示当药苷能有效地减少四氯化碳导致的胶原沉积,具有显著地抗纤维化作用,并且通过肝脏中羟脯氨酸进一步证实当药苷的抗纤维化作用。 3.α-SMA免疫组化结果显示当药苷能够有效地抑制α-SMA的表达,抑制肝星状细胞的活化,从抑制肝星状细胞活化与增殖角度证实当药苷对于肝纤维化的保护作用。 4.通过体外对肝星状细胞进行计数分析以及平板克隆实验,结果表明当药苷体外能够显著抑制肝星状细胞的增殖。 5.RT-PCR结果显示在肝纤维化模型中当药苷能够促进fxr及miR-29a的表达,并能够显著抑制肝纤维化col1a1、timp1等相关基因的表达;western blot结果显示从蛋白水平当药苷同样能够抑制COL1以及TIMP1的表达;体外实验当药苷能显著抑制肝星状细胞中COL1、TIMP1等肝纤维化相关基因的表达;western blot及ELISA结果进一步证实了当药苷能够显著抑制肝星状细胞中COL1、TIMP1的表达。 6.通过体外转染siFXR以及miR-29a的抑制剂,分别将FXR及miR-29a沉默后结果显示当药苷对肝星状细胞增殖的抑制作用消失了,同时当药苷无法抑制COL1以及TIMP1的表达。提示当药苷抑制肝星状细胞的增殖及其对肝纤维化的保护作用与FXR及miR-29a有关。 结论: 1.环烯蓬萜苷类化合物当药苷能够有效对抗四氯化碳所导致的急性肝损伤。 2.当药苷能够有效地降低四氯化碳所致的肝脏胶原纤维的沉积,抑制col1a1、timp1等肝纤维化相关基因的表达,表明当药苷能够有效地保护四氯化碳所致的肝纤维化。 3.体外实验研究表明当药苷能够有效抑制活化的肝星状细胞的增殖,抑制肝星状细胞中COL1、TIMP1的表达。 4.结合体内体外药效评价表明当药苷的作用机制有可能是通过调控FXR/miR-29a来发挥其抗肝纤维化作用。