基于生物信息学方法建立HBV相关肝癌预后免疫基因风险预测模型

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目的:通过生物信息学的方法寻找与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关肝癌发生发展相关的免疫基因,并建立风险预测模型。为后续HBV相关肝癌患者的风险预测提供模型参考,并为临床预后免疫研究工作提供相关标志物。方法:(1)从TCGA数据门户网站(https://cancergenome.nih.gov/)下载HCC样品的RNA-seq数据,对测序的原始数据进行标准化处理,从而获得可供分析的基因组基因的表达数据。筛选出HBV相关肝癌样本和癌旁组织样本的基因表达数据以及组织样本患者的临床数据。(2)通过免疫学数据库和门户分析网站(innate DB)数据库导出IRGs。在TCGA中HBV相关肝癌的基因表达数据中筛选得到HBV相关肝癌IRGs。然后通过R“e dge R”和“limma”软件包进行差异表达分析,筛选HBV相关肝癌组织样本与癌旁组织样本之间差异表达的IRGs,设置错误发现率(false discovery rat e,FDR)1作为阈值。(3)利用Web在线工具“DAVID”进行GO(gene ontology,基因本体)功能注释与KEGG(k yoto encyclopedia of genes and genome,京都基因与基因组百科全书)通路富集分析,以探索差异表达的IRGs可能参与的生物进程和信号通路。(4)应用R软件“survival”包进行单因素COX比例风险回归分析,随后将COX单因素有统计学意义的差异IRGs纳入多因素COX比例风险回归模型,利用多因素COX回归系数建立风险预测模型及预后风险得分(Risk Score)。(5)预后模型的效果评价和验证:进行Kaplan-Meier生存分析和画出预测模型的ROC曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC曲线),求得ROC下曲线面积(area under curve,AUC)值和cutoff值,以检测所建预后风险模型的预测的准确性。随后根据cutoff值将患者分为高风险组和低风险组。通过Kaplan-Meier生存分析检验多基因预后模型在HBV相关肝癌中的临床预后价值。(6)通过TCIA数据库进行HBV相关肝癌样本中免疫细胞浸润程度,建模基因的基因组序列进行研究。(7)利用GEO数据库做为验证集对建立的风险预测模型进行验证。结果:(1)通过TCGA数据库筛选出95个HBV相关肝癌组织样本,50个癌旁。每个样本有19754个基因的转录组数据。(2)19754个基因与i nnate DB数据库中的IGRs进行交集得到3876个与人体免疫功能相关联的基因。(3)利用R语言中的“edge R”和“limma”对HBV相关肝癌的免疫基因表达数据进行分析,得到516个差异IRGs,其中315个上调基因,201个下调基因。(4)GO富集分析结果表明“氧化还原过程”,“细胞基质外泌体”,“蛋白质的异二聚活性”分别是生物进程、细胞成分和分子功能中最显著的生物学项目。KEGG富集分析结果可知差异表达的IRGs富集在“代谢途径”信号通路。(5)单因素COX回归分析后筛选出49个差异IRGs,随后多因素COX比例风险回归模型筛选出6个预后相关IRGs,建立了预后免疫基因风险预测模型。Risk Score=(RPL23A*-0.00916)+(SERTAD2*0.495443)+(MTRF1*-1.10422)+(NUCB2*-0.09583)+(RAD23A*-0.05712)+(TLL2*9.564602)。(6)按这6个基因建立的风险预测模型中cuttoff值划分,可知风险模型样本中HBV相关肝癌高风险患者的OS明显较低风险患者低(p=0.0056),在独立验证样本中得到了相同的结果(p=0.0033)。TCGA数据中风险预测模型的AUC=0.692,模型独立验证样本中的AUC=0.635,说明该预测模型具有较好的预测能力。(8)通过TCIA数据库可知本研究得到的风险预测模型中6个基因的基因组序列的遗传变化主要集中于DNA片段的扩增和深度缺失。而免疫细胞浸润中以巨噬细胞浸润数量最多。结论:本研究基于不同公共数据库中HBV相关肝癌患者的高通量表达谱数据而建立包含6个预后相关IRGs的HBV相关肝癌的风险预测模型。这个风险模型通过对HBV相关肝癌患者的预后预测,为临床个体化治疗以及随访提供了候选标志物。并为今后HBV相关肝癌发生发展的免疫机制研究补充了一定的理论基础。
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