背景与目的肺癌因其持续的细胞增殖能力和潜在的转移性成为一种高发病率和高死亡率的疾病。尽管近年来在肺癌的诊断方法和治疗策略上已取得重大进展,但绝大多数病人仍不可避免地进展到晚期阶段。肺癌分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),其中 NSCLC约占肺癌的85%以上,因而成为主要的研究对象。近年来,随着高通量测序和生物信息学的快速发展和普遍应用,长非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)逐渐进入科学家的视野,成为研究的热点。LncRNAs是一类转录本长度超过200nt,因缺少有效开放阅读框而不编码蛋白质的RNA分子。它们能够参与到多个正常生理学或病理学过程,比如细胞分化,胚胎发育,细胞增殖凋亡和转移等。多项研究已经证实lncRNAs在多种人类肿瘤中表达失调,发挥致瘤或抑瘤的生物学功能。长非编码RNAlinc00673编码于17号染色体长臂1q25,全长约2275 nt。通过生物信息学分析网络数据库GSE18842,我们发现linc00673是NSCLC组织中上调最明显的长非编码RNA。有研究也已证实linc00673在NSCLC组织中的表达上调,但关于它所发挥的生物学功能及作用机制未做进一步探究。本课题将首先在手术切除NSCLC组织及匹配正常肺组织中检测linc00673的表达水平及其与临床病理资料之间的关联性,接着分别通过体外细胞实验和体内动物实验探究linc00673表达异常对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响,再通过一系列实验方法探索linc00673的分子机制,为NSCLC的发病机制及治疗靶点提供新的理论依据。材料与方法1.一共收集80例手术切除的NSCLC组织及其配对正常肺组织标本,通过Trizol法提取RNA后逆转录成cDNA,再运用定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction,qRT-PCR)分别检测 NSCLC 组织及配对正常肺组织标本中linc00673和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phophatedehydrogenase,GAPDH)的表达水平。同时汇总所有患者的临床病理资料,利用统计学方法分析得出linc00673表达水平与临床病理资料之间的相关性。再绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)检测linc00673作为NSCLC诊断标志物的敏感性和特异性。2.利用qRT-PCR方法检测linc00673在8种NSCLC细胞系和人源支气管上皮细胞系(human bronchial epithelial cell,HBE)中的基础表达量。同时运用核质分离技术检测linc00673的亚细胞定位。体外构建含linc00673全长序列的质粒pcDNA3.1-linc00673 及特异性抑制 linc00673 的小干扰 RNA(short interfering RNA,siRNA)siRNA-linc00673。根据 linc00673 在 8 种 NSCLC 细胞系中的基础表达量,将linc00673基础表达水平较高的A549、H1975细胞系转染siRNA-linc00673和非特异性对照siRNA,linc00673基础表达水平较低的H1703细胞系转染过表达质粒pcDNA3.1-linc00673和空载质粒pcDNA3.1。运用qRT-PCR方法检测不同处理组细胞中linc00673的表达水平,验证干扰和过表达效率。3.细胞实验部分,采用MTT、平板细胞克隆形成和EdU免疫染色实验检测linc00673异常表达对细胞增殖能力的影响。通过流式细胞仪方法检测linc00673异常表达对细胞周期进程和细胞凋亡的影响。4.动物实验,用4周龄雄性BALB/c裸鼠中构建皮下肿瘤模型,分为A549空载质粒组和A549 shRNA-linc00673组,每组6只裸鼠。于裸鼠右侧腋窝皮下注射2×106个细胞,种植后第4天可以观察到可测量的皮下瘤,每隔3天测量皮下瘤的最大径D及最小径d,根据体积=Dd2/2公式计算出每组肿瘤的大小,画出瘤体生长曲线,2周后取出皮下瘤组织并称重,最后统计分析。Trizol法提取两组皮下瘤组织的RNA,qRT-PCR检测linc00673表达水平。同时将瘤体固定切片,行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)和免疫组化方法检测增殖细胞相关的核抗原Ki-67。5.为探究linc00673参与NSCLC发生发展的分子机制,首先将经siRNA-linc00673和scramble序列(阴性对照)处理的A549细胞进行转录组测序,通过生物信息学分析和qRT-PCR验证寻找可能的下游靶基因。再运用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)和 RNA pull down方法验证能与linc00673结合的蛋白质。接着再利用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)验证RNA结合蛋白是否作用于下游靶基因的启动子区。6.构建下游靶基因的过表达质粒,转染A549和H1975细胞系后,运用MTT、平板细胞克隆形成、EdU免疫染色实验检测细胞增殖能力的改变。接下来,将H1703细胞共转染linc00673和靶基因的质粒,再运用MTT、克隆形成、EdU免疫染色实验检测细胞增殖能力的改变,即通过挽救实验进一步明确靶基因的功能缺失参与了 linc00673的致瘤作用。7.运用qRT-PCR检测NSCLC组织及其配对正常肺组织标本中靶基因的表达水平,并分析其与linc00673表达的相关性。运用组织芯片分析靶基因与患者预后的相关性。结果1.与正常肺组织相比,linc00673在NSCLC组织中的表达升高,且与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期具有相关性:研究一共纳入80例NSCLC患者,其中62例NSCLC组织的linc00673表达水平较对应正常肺组织的升高。根据linc00673的qRT-PCR结果分为高表达组和低表达组,结合患者的临床病理资料经统计学分析发现linc00673表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期具有明显相关性(P=0.015、P=0.047及P=0.033),但与年龄、性别、分化程度及吸烟史无明显相关性。绘制 ROC 曲线(receiver operating characteristic curve)评估 linc00673的临床诊断价值,AUC(area under the curve)=0.683,cut off =7.75,敏感性 68.75%,特异性66.25%。综上结果提示linc00673是促进NSCLC发生发展的重要因子,且可作为较好的NSCLC诊断标志物。2.Linc00673在NSCLC细胞系中的表达水平及亚细胞定位:以HBE细胞系为参照,qRT-PCR检测结果显示linc00673在6种NSCLC细胞系中表达量较高,而在H1703、H226细胞系中表达量较低。通过核质分离的技术,发现linc00673在A549、H1975和H1703三种细胞系的细胞核、细胞质中均有分布,提示linc00673可以从转录水平、转录后水平发挥复杂的生物学功能。构建特异性抑制linc00673的siRNA和过表达linc00673的质粒。根据qRT-PCR结果,选择A549、H1975细胞系为干扰实验对象,H1703细胞系为过表达实验对象。转染si-RNA或过表达质粒48小时后,提取RNA检测干扰效率可达到80%以上,过表达效率约210倍。3.Linc00673表达下调后抑制NSCLC细胞增殖、使细胞阻滞于G1期,但不影响细胞凋亡:MTT实验结果显示,与对照组细胞相比,A549、H1975细胞系下调linc00673表达后细胞的增殖速度减慢(P<0.01),而H1703细胞系过表达linc00673后细胞的增殖速度增加(P<0.01)。平板细胞克隆形成实验显示,下调linc00673表达后,形成的细胞克隆数较对照组的减少(P<0.05),而过表达linc00673后,形成的细胞克隆数较对照组的增多(P<0.05)。EdU实验进一步证实下调或过表达linc00673后细胞的增殖能力相应地减弱或增强。以上实验结果说明linc00673可以增强细胞的增殖能力和群体依赖性。流式细胞技术结果显示下调linc00673表达后的细胞呈现明显的细胞周期G0/G1期阻滞(P<0.05)。相反,过表达linc00673后处于G0/G1的细胞减少,而处于S期的细胞增多。此外,实验结果显示下调linc00673表达后细胞凋亡比例与对照组的相似。提示linc00673促进细胞增殖是通过影响细胞周期进程,而非影响细胞凋亡。4.Linc00673表达下调后抑制NSCLC细胞的成瘤性:Linc00673表达下调组的皮下瘤体积较对照组的小(P<0.01),瘤体重量也较对照组的轻(P<0.01)。qRT-PCR方法检测瘤体中linc00673的表达水平,实验组皮下瘤组织中linc00673的表达水平较对照组的下调(P<0.05)。对两组皮下瘤组织行HE染色和Ki-67免疫染色,结果显示linc00673表达下调组的Ki-67阳性率较对照组的降低。综上动物实验结果证实linc00673能够发挥致瘤作用,下调linc00673表达后能够显著抑制NSCLC细胞的成瘤能力。5.Linc00673通过绑定蛋白LSD1抑制NCALD的转录,发挥促瘤作用:将A549细胞系分别转染scramble和siRNA-linc00673后进行转录组测序分析,发现下调linc00673 后,998 个基因产生差异性表达(log2(FoldChange)|>1 and P<0.05),包括499个上调基因的和489个下调基因。通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)进行通路分析发现细胞周期通路受linc00673调控,这也与细胞实验结果相符合。结合测序结果和qRT-PCR筛选出具有代表性的基因,其中NCALD的表达上调最明显,western blot也证实其蛋白水平也相应地上调。由此推测linc00673可能是通过调控NCALD发挥致瘤效应。既往研究证实了长非编码RNA通过结合RBPs(RNA binding proteins)以沉默下游靶基因这一机制。首先运用 RNA-Protein interaction prediction website(http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/)分析出 linc00673 能够与染色质修饰蛋白EZH2、SUZ12、LSD1结合。在NSCLC细胞系中下调LSD1后,qRT-PCR和western blot结果发现NCALD的mRNA和蛋白水平均上调,而下调EZH2或LSD1后未观察到类似结果。由此提示linc00673很可能是通过绑定LSD1调控NCALD。接下来通过RIP和RNApulldown实验证实了 linc00673能够和LSD1相结合。最后,通过ChIP实验证实LSD1能够结合到NCALD的启动子区域,使组蛋白的H3K4位点发生支甲甚化,讲而抑制NCALD的转录。6.过表达NCALD后抑制NSCLC细胞的增殖能力,且可部分抵消linc00673的致瘤作用:MTT、EDU和平板克隆实验结果显示,与对照组细胞相比,A549、H1975、SPC-A1过表达NCALD后细胞的增殖速度减慢(P<0.05,P<0.05),细胞克隆数目减少(P<0.05)。进一步的挽救实验证实,过表达NCALD可以部分抑制linc00673的促细胞增殖能力(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。7.与正常肺组织相比,NCALD在NSCLC组织中的表达下调,且NCALD低表达提示预后差:通过数据库Oncomine上的两个肺癌组织芯片分析得出NCALD在NSCLC组织中的表达水平较正常组织中的低。在临床组织标本中验证得出同样结论,且NCALD与linc00673的表达具有负相关性(r2=0.3205,P= 0.0006)。通过组织芯片分析发现NCALD低表达者的总生存期较NCALD高表达者的生存期短(p=0.0449)。结论与意义1.Linc00673表达失调是NSCLC发生发展过程中的重要因素,且可作为诊断NSCLC的分子标志物:Linc00673在NSCLC组织中呈现高表达的趋势,且与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期呈正相关性,提示其表达升高是促进NSCLC发生发展的重要因素。ROC曲线证实linc00673具有较好的诊断特异性和敏感性。2.Linc00673通过绑定LSD1抑制NCALD的转录,促进NSCLC细胞增殖:Linc00673能够绑定LSD1,使NCALD启动子组蛋白H3K4位点发生去甲基化,抑制其转录,进而促进NSCLC细胞增殖,发挥癌基因的功能。这为阐明NSCLC分子机制提供了新的理论甚础。3.体内实验证实linc00673表达下调后可抑制裸鼠皮下瘤的生长:Linc00673表达下调后可以明显抑制裸鼠皮下种植肿瘤的生长,降低瘤体重量和Ki-67阳性率。这为抑制NSCLC发生发展提供了新的靶点,具有临床转化和产业化前景。