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自然流产（SA）是常见的生殖障碍疾病,已有研究证明绒毛外滋养细胞功能的改变是自然流产发生的关键环节。课题组在前期实验已经验证miR-126-3p在自然流产患者绒毛组织中表达上调,且能影响滋养细胞的侵袭和迁移功能,并发现孕激素受体（PR）可以通过Akt通路调控Bcl-2、Bax的表达影响滋养细胞凋亡的发生。又通过生信分析筛选出FOXO3和PLXNB2可能是miR-126-3p在自然流产中的下游两个直接作用蛋白,而查阅文献发现FOXO3的研究多与细胞凋亡相关且与PR有直接结合作用靶点,PLXNB2则多能影响细胞的侵袭和迁移功能。减味寿胎丸是补肾安胎法的代表组方之一,续断皂苷Ⅵ则是组方中续断的主要活性成分之一,它们能否通过miR-126-3p影响SA的药效作用机制尚未被研究。因此本课题主要研究miR-126-3p是否通过介导FOXO3调控PR影响细胞凋亡作用自然流产和miR-126-3p是否通过下游基因PLXNB2影响细胞侵袭和迁移功能作用自然流产的发生及其具体作用机制,并探讨减味寿胎丸、续断皂苷Ⅵ能否通过下调miR-126-3p降低自然流产的发生率。目的:从体内和体外（包括临床、细胞和动物）两大部分,探讨miR-126-3p介导FOXO3调控PR影响细胞凋亡作用自然流产和miR-126-3p调控下游基因PLXNB2影响细胞侵袭和迁移功能作用自然流产的具体作用机制。并探讨减味寿胎丸（JWSTW）、续断皂苷Ⅵ（ASA Ⅵ）是否通过下调miR-126-3p减少对下游靶蛋白的抑制从而影响自然流产的发生。方法:1.临床研究（1）经伦理委员会批准（批号:中医一院伦审[2014]050号）,选取在广州中医药大学第一附属医院日间手术室自愿行人工流产患者的绒毛组织,其中自然流产患者的绒毛组织（n=25）与正常早孕患者绒毛组织（n=25）。（2）通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA在自然流产患者的绒毛组织与正常早孕患者绒毛组织之间的表达差异。（3）免疫印迹试验（WB）检测FOXO3、PR、PLXNB2在自然流产患者的绒毛组织与正常早孕患者绒毛组织之间的蛋白表达差异。（4）苏木精—伊红染色法（HE）染色观察FOXO3、PR、PLXNB2在自然流产患者的绒毛组织与正常早孕患者绒毛组织之间的组织形态学变化。（5）免疫组化（IHC）检测FOXO3、PR、PLXNB2在自然流产患者的绒毛组织与正常早孕患者绒毛组织之间的表达差异。2.细胞研究（1）过表达miR-126-3p慢病毒包装,转染至HTR-8/Svneo细胞株中,构建慢病毒过表达miR-126-3p稳转细胞株。（2）用 RT-qPCR 检测 FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA 在慢病毒过表达 miR-126-3p 滋养细胞株中的表达差异。（3）WB检测FOXO3、PR、PLXNB2在慢病毒过表达miR-126-3p滋养细胞株中的蛋白表达差异。（4）通过染色质免疫共沉淀（ChIP）、双荧光素酶报告验证miR-126-3p与FOXO3、FOXO3与PR、miR-126-3p与PLXNB2的结合位点及调控关系。（5）JWSTW、ASA Ⅵ干预慢病毒过表达miR-126-3p滋养细胞后,用RT-qPCR检测 FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA 的表达差异。（6）JWSTW、ASA Ⅵ干预慢病毒过表达miR-126-3p滋养细胞后,用WB检测FOXO3、PR、PLXNB2的蛋白表达差异。（7）JWSTW、ASA Ⅵ干预慢病毒过表达miR-126-3p滋养细胞后,用划痕试验和Transwell实验验证滋养细胞迁移和侵袭功能的变化。3.动物实验研究（1）选7～8周龄未交配过的SPF级SD雌鼠120只和雄性50只按2:1进行合笼交配,将每天检查获得的妊娠鼠随机分为阴性对照组、模型对照组、阳性对照组、减味寿胎丸低剂量组、减味寿胎丸高剂量组、续断皂苷Ⅵ低剂量组、续断皂苷Ⅵ高剂量组,按照陈奇主编的《中药药理研究方法学》附录二换算给药,直至阴性对照组和模型对照组至少12只/组,其余组别至少15只/组,单笼饲养。自GDO起至GD13,每天灌胃相应的样品,GD13上午灌胃10 mg/kg体重的米非司酮,24 h后麻醉采血,剖检。（2）用RT-qPCR检测FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA在流产大鼠模型子宫胚胎结合部的表达差异。（3）用WB检测FOXO3、PR、PLXNB2蛋白在流产大鼠模型子宫胚胎结合部的表达差异。（4）JWSTW、ASA Ⅵ干预流产大鼠模型后,用RT-qPCR检测各组大鼠子宫胚胎结合部FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA的表达差异。（5）JWSTW、ASA Ⅵ干预流产大鼠模型后,用WB检测各组大鼠子宫胚胎结合部FOXO3、PR、PLXNB2蛋白的表达差异。（6）HE染色观察FOXO3、PR、PLXNB2在流产大鼠模型子宫胚胎结合部组织的形态学的改变。（7）体视镜立体全面观察大鼠子宫胚胎组织的形态学的改变。（8）IHC检测药物减味寿胎丸、续断皂苷Ⅵ干预后各组间大鼠流产模型子宫胚胎结合部组织FOXO3、PR、PLXNB2的表达差异。结果:1.自然流产患者（SA）的绒毛组织较正常早孕妇女（N）绒毛组织中的miR-126-3p的表达上调,FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA（P<0.001）及蛋白（P<0.05）表达降低,具有统计学差异。2.HE染色显示SA的绒毛组织较N出现大量坏死,且有核溶解等炎症反应。3.在慢病毒过表达 miR-126-3p 滋养细胞中 FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA（P<0.01）和蛋白（P<0.05）的表达下调,有统计学差异,JWSTW、ASA Ⅵ干预后表达显著上调,有统计学差异（P<0.05）。4.双荧光素酶报告显示在工具细胞中过表达miR-126-3p能抑制FOXO3的表达,FOXO3是miR-126-3p的靶基因（P<0.001）,FOXO3与PR能结合,并能抑制其表达（P<0.001）。miR-126-3p 与 PLXNB2 能结合,且 miR-126-3p 能抑制 PLXNB2 的表达（P<0.001）。ChIP检测FOXO3与PR在Promoter区相比Exon区没有明显的富集（P>0.05）。EMSA验证FOXO3在慢病毒过表达miR-126-3p滋养细胞中（M-N）较阴性对照组（MN-N）比表达明显下调,而在JWSTW干预过表达组（M-JW）较对照组（MN-JW）表达明显上调。5.JWSTW、ASA Ⅵ干预慢病毒过表达miR-126-3p滋养细胞后,FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA和蛋白的表达上调（P<0.05）。JWSTW、ASA Ⅵ干预慢病毒过表达miR-126-3p滋养细胞后,促进滋养细胞迁移和侵袭功能。6.在SD流产大鼠模型中Model组的流产率较其他各组显著升高,JWSTW、ASA Ⅵ干预后流产率下降,有统计学差异（P<0.05）。7.体视镜观察SD流产大鼠胚胎形态的改变,发现model组有明显的瘀血,而药物干预组胚胎表面圆润,血管丰富。8.FOXO3、PR、PLXNB2 mRNA及蛋白在SD流产大鼠模型的子宫胚胎结合部组织中model组较control组表达下调,有统计学差异（P<0.05）。JWSTW、ASA Ⅵ干预后,表达显著上调,有统计学差异（P<0.05）。9.在SD流产大鼠模型子宫结合部位,发现流产模型组（model组）较正常组（control组）见有宫腔内脱落的内膜组织,腺体较少,炎性细胞浸润。而减味寿胎丸（JWSTW）、续断皂苷Ⅵ（ASA Ⅵ）干预后可见腺体减少不明显,结构较规则。结论:1.SA患者绒毛组织中FOXO3和PR的表达降低,可能是miR-126-3p在SA患者中的异常表达抑制了 FOXO3和PR的表达所致。同时FOXO3和PR的基因蛋白的表达下调,可能促使细胞凋亡增加,从而导致SA中绒毛和蜕膜组织在形态上出现大量坏死,引起自然流产发生。2.miR-126-3p可能通过抑制PLXNB2在SA患者绒毛组织中基因蛋白的表达,使SA绒毛组织在形态上出现大量细胞核溶解,进一步出现细胞坏死,蜕膜组织中出现炎症反应,影响妊娠的子宫内膜蜕膜化,引起自然流产的发生。3.在HTR-8/Svneo细胞中过表达miR-126-3p能直接抑制下游靶基因FOXO3下调PR的表达从而影响自然流产母胎界面的滋养层细胞的凋亡功能,。在HTR-8/Svneo细胞中过表达miR-126-3p下调其下游靶基因PLXNB2的表达,抑制自然流产母胎界面滋养层细胞的侵袭和迁移功能。4.在慢病毒过表达miR-126-3p的滋养细胞中,补肾安胎组方减味寿胎丸和单体ASA Ⅵ可能通过抑制miR-126-3p的表达,促进FOXO3在滋养细胞中表达从而上调PR的表达来调控自然流产母胎界面滋养层细胞的免疫应答和凋亡功能。5.在慢病毒过表达miR-126-3p的滋养细胞中,减味寿胎丸和单体ASA Ⅵ可能通过抑制miR-126-3p的表达,促进PLXNB2“推动器”的作用促进母胎界面滋养层细胞的侵袭和迁移功能使滋养细胞顺利植入蜕膜和胎盘,维持胎儿的正常发育。6.采用米非司酮构建了 SD大鼠流产模型,观察到Model组大鼠较其他组能见到明显的阴道出血,通过体视镜见Model大鼠胚胎表面有明显的瘀血,血管分布及供血较其他各组少,通过计算流产率发现Model组大鼠的流产率较control组明显升高,为用米非司酮造流产模型提供依据。并体内研究进一步证明了复方JWSAT和单体ASAⅥ通过降低大鼠流产率维持大鼠的继续妊娠。并通过检测大鼠子宫胚胎结合部位组织的基因和蛋白,发现药物干预大鼠模型组子宫内FOXO3、PR和PLXNB2表达升高,可能通过降低大鼠子宫内的炎症反应,维持妊娠。