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桂花(Osmanthus fragrans Lour)又名木犀、岩桂和九里香,是木犀科木犀属植物,原产我国,是特有的常绿阔叶灌木或小乔木经济树种,具有2500多年的栽培历史,是我国十大传统名花之一。桂花因具有丰富的颜色和独特的芳香,从古至今备受人们喜爱,而且在观赏、食品、药用和香料等方面具有广泛的应用价值。根据开花时期、花色花香等特征,桂花可以分为银桂品种群、四季桂品种群、金桂品种群、丹桂品种群和彩叶桂品种群。研究发现,桂花花瓣的颜色是由类胡萝卜素含量决定的,花瓣中类胡萝卜素的含量越高,花瓣的颜色越深。桂花花瓣类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase,CCD)CCD1和CCD4可以裂解类胡萝卜素产生芳香物质紫罗兰酮(包括α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮),使桂花具有独特的香味。因此,CCD1和CCD4是桂花类胡萝卜素裂解和紫罗兰酮产生的关键基因。本研究利用分子生物学方法研究桂花ERF2转录因子对桂花CCD1和CCD4基因表达的调控,主要研究结果如下:(1)桂花ERF2基因克隆及CCD1、CCD4和ERF2基因的表达模式分析设计特异性引物扩增ERF2基因,该基因编码区全长732 bp,编码244个氨基酸。Blast比对显示,ERF2含有1个AP2结构域,与油橄榄(Olea europaea)、芝麻(Sesamum indicum)和烟草(Nicotiana tabacum)的ERF2氨基酸序列具有较高的同源性,桂花ERF2蛋白与油橄榄(Olea europaea)具有较近的亲缘关系。RT-PCR结果显示,不同花期银桂和丹桂花瓣中CCD1、CCD4与ERF2基因表达模式基本一致,推测ERF2转录因子可能参与了CCD1和CCD4基因表达的调控。(2)ERF2转录因子亚细胞定位构建35S::ERF2重组表达载体,以35S::GFP载体作为对照,利用农杆菌介导的瞬时转化技术转入烟草,25℃培养3天后,荧光显微镜下观察。发现对照叶片细胞中绿色荧光主要集中在细胞质中,而ERF2超表达的叶片细胞中绿色荧光集中在细胞核中,表明ERF2转录因子定位在细胞核中。(3)桂花ERF2基因在烟草叶片中超表达促进了烟草CCD1和CCD4基因的表达利用农杆菌瞬时转化法将35S::ERF2和35S::GFP载体分别转化入烟草,于25℃培养3天后,提取叶片中的RNA,利用荧光定量PCR检测CCD1和CCD4基因的表达量。结果表明,ERF2基因超表达促进了CCD1和CCD4基因的表达。(4)桂花ERF2转录因子与CCD1和CCD4基因启动子相关元件的相互作用分析将35S::ERF2超表达载体分别与CCD1pro::GUS和CCD4pro::GUS重组载体通过农杆菌瞬时转化转入烟草,以35S::GFP/CCD1pro::GUS和35S::GFP/CCD4pro::GUS载体组合作为对照。25℃培养3天后,利用组织化学染色法和荧光定量PCR对烟草叶片中GUS蛋白活性与GUS基因的表达量进行检测,结果显示,对照叶片分别显示微弱蓝色,而ERF2超表达的烟草叶片分别显示较深蓝色,而且ERF2超表达的烟草叶片中GUS基因的表达量显著高于对照组。说明ERF2转录因子可以与CCD1和CCD4基因启动子相关元件结合,从而使GUS基因表达上调。(5)OfERF2蛋白的原核表达与纯化构建pET-30a-ERF2原核蛋白表达载体,转入BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现35KD大小的ERF2目的蛋白条带,并纯化了ERF2蛋白。(6)凝胶迁移阻滞实验(EMSA)验证ERF2蛋白与CCD1和CCD4基因启动子上相关元件的相互作用体外合成含有CCD1和CCD4基因启动子上的ERF转录因子结合元件的探针,利用EMSA实验验证ERF2蛋白与相关元件相互作用。结果表明,同时加入ERF2蛋白和荧光标记的元件电泳时,出现了明显的滞留条带,说明ERF2蛋白可以和CCD1和CCD4基因启动子上的ERF转录因子结合元件在体外结合。