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热休克蛋白(Heat shock protein,HSPs),又称应激蛋白,在各种生物中普遍存在,高度保守。按分子量不同,HSPs可以分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子家族。在正常生理条件下,HSPs正常表达,在新生蛋白折叠、转运等过程中发挥重要生理作用;当机体细胞受到各种应激时,HSPs表达含量会显著变化。近来研究表明,HSPs与肿瘤的发生与发展有着密切的相关性。在MDV引起鸡肿瘤的发生、发展过程中,HSP60表达量显著升高,且主要定位于肿瘤细胞的胞浆中,暗示着HSP60对肿瘤细胞的增殖发挥着重要生物学作用。而HSP60表达量高低对于肿瘤细胞凋亡的生物学作用未见报道。MDCC-MSB1细胞是MD成淋巴细胞样细胞系。本课题将MDCC-MSB1细胞作为研究对象,通过设计合成HSP60的siRNA干扰序列,构建siRNA慢病毒,抑制MDCC-MSB1内HSP60的转录和表达,利用荧光定量RT-PCR、Western Blot、流式细胞术等方法检测HSP60的转录、表达水平及MDCC-MSB1细胞凋亡情况,研究HSP60表达量与MDCC-MSB1细胞凋亡之间的相关性,阐述HSP60在肿瘤细胞增殖过程中的生物学作用。根据NCBI公布的鸡HSP60和GAPDH基因mRNA序列,利用Primer premier 5.0生物软件及参考文献,设计并合成6对引物,通过梯度普通PCR及梯度荧光定量PCR,对各引物扩增条件进行了优化。回收PCR扩增的基因片段,连接pUCm-T载体,转化DH5α感受态细胞,筛选、鉴定重组质粒,系列稀释作为阳性标准品,制作标准曲线。优化了鸡HSP60荧光定量RT-PCR方法,并对其扩增效率、敏感性、特异性进行了检测。结果证明,建立的荧光定量RT-PCR方法可以真实地反映反应管中模板初始数量,HSP60、GAPDH标准曲线斜率接近,扩增效率良好,可用于MDCC-MSB1细胞中HSP60和GAPDH基因mRNA水平的检测。根据NCBI公布的HSP60序列,设计3条RNA干扰序列,构建慢病毒,优化慢病毒转染MDCC-MSB1细胞的条件,利用荧光定量PCR、WesternBlot等技术,检测RNA干扰效果。结果表明,慢病毒浓度为1×10~8TU/mL,不添加助转染试剂,转染效率最佳,细胞状态良好;成功构建了MDCC-MSB1细胞HSP60 RNA干扰慢病毒。其中5147序列慢病毒干扰效果最佳,转染36 h时,转录水平、蛋白表达水平分别比对照序列慢病毒组下降88.6%和70.6%;转染48 h时,与空白对照组相比转录水平、蛋白表达水平分别比对照序列慢病毒组下降87.7%和75.9%。利用5147序列慢病毒转染MDCC-MSB1细胞,转染后48 h时,收集细胞,利用荧光定量PCR、Western Blot以及流式细胞技术,检测HSP60转录表达水平以及细胞凋亡水平。结果显示,5147序列慢病毒干扰48 h时,MDCC-MSB1细胞HSP60转录、表达水平分别降低81.1%和85.2%,细胞凋亡率提高46.9%。证明通过降低HSP60的表达水平,能够导致MDCC-MSB1细胞凋亡升高。