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RNA沉默在植物抗病毒防御中扮演一个重要的作用。为了抵抗寄主防御,植物病毒编码病毒RNA沉默抑制子锚定RNA沉默途径中的不同效应分子。草莓镶脉病毒(SVBV)P6基因编码一个涉及病毒RNA转运、寄主症状确定、抑制RNA沉默和内含体形成的多功能蛋白。本研究利用16c本氏烟共浸润系统确定了SVBV编码的P6蛋白是唯一的沉默抑制子。P6蛋白可抑制单链GFP(S-PTGS)诱发的沉默,而不能抑制双链GFP(IR-PTGS)诱发的沉默。缺失突变分析证明,P6蛋白核定位信号(NLS)影响沉默效应。此外,进一步研究说明P6蛋白既不能回复TRV介导的内源基因PDS的系统沉默,也不能抑制TRV介导的内源基因PDS/Su的系统沉默。1.P6蛋白是SVBV编码的唯一的沉默抑制子为了证明SVBV编码的蛋白参与了RNA沉默抑制,我们利用基于转GFP基因的16c本氏烟的瞬时沉默抑制体系,表明仅P6能抑制GFP诱发的局部沉默。紫外灯下观察共浸润6天后的浸润区,发现有明显的绿色荧光,Northern blot和Western blot分析发现,P6和GFP共浸润16c本氏烟6天后,GFP相应的m RNA和蛋白的积累量显著增加,而GFP的siRNAs积累量明显降低,表明SVBV编码的P6蛋白是唯一的RNA沉默抑制子。2.P6蛋白能抑制单链GFP介导的沉默,而不能抑制双链GFP介导的沉默在植物中,PTGS可以通过正义链RNA(S-PTGS)或者反向重复RNA(IR-PTGS)介导触发。为了确定P6在RNA沉默途径中的精确环节,我们研究了P6对S-PTGS和IR-PTGS的抑制能力。在S-PTGS和IR-PTGS共浸润本氏烟系统中,35S:FP和35S:dsFP分别作为RNA沉默诱发子。农杆菌共浸润本氏烟,发现P6蛋白能抑制单链GFP诱发的沉默,而不能抑制dsGFP诱发的沉默。研究表明,P6能抑制单链GFP诱导的RNA沉默,且能阻止siRNAs生成。3.P6蛋白核定位信号(NLS)影响沉默效应为了确定P6蛋白抑制RNA沉默的功能域,基于生物信息学预测P6蛋白二级结构构建了4个缺失突变体,分别是pCAM-P616m、pCAM-P6?144-188aa、pCAM-P6?193-223aa和pCAM-P6?402-426aa。农杆菌共浸润16c本氏烟,发现P6、P616m、P6?144-188aa和P6?193-223aa都能够抑制PTGS,但要弱于P19的抑制能力,而已确定的核定位信号区域402-426 aa缺失后不能抑制PTGS的活性,失去了抑制沉默效应的能力。研究结果表明,P6蛋白核定位信号(NLS)影响沉默效应。4.P6蛋白不能回复TRV介导的内源基因PDS的系统沉默为了验证瞬时表达的P6蛋白回复VIGS介导的内源基因的系统沉默的作用,将本氏烟的内源基因PDS插入到已改造的TRV病毒载体,TRV-PDS作为沉默诱发子,包含GFP的C末端250 bp的TRV-GFP作为阴性对照。12天后,已沉默PDS的本氏烟被浸润PVX-P6。研究结果表明,浸润30天后,瞬时表达的P6不能回复TRV介导的内源基因PDS的系统沉默。5.P6蛋白不能抑制TRV介导的内源基因PDS/Su的系统沉默进一步探究P6蛋白在抑制VIGS诱发的内源基因的系统沉默中的作用,基于TRV载体,我们检测了P6蛋白是否能抑制内源基因PDS/Su的系统沉默。将P6构建到PVX载体上,利用农杆菌浸润野生型本氏烟10天后,PVX-P6浸润后表现严重花叶、畸形、心叶下卷等症状,PVX浸润后表现轻花叶症状。已浸润瞬时表达P6和模拟对照的本氏烟分别被浸润TRV-PDS或TRV-GFP,TRV-GFP为阴性对照。30天后,瞬时表达的P6不能抑制TRV介导的内源基因PDS的系统沉默。另外,转P6基因的本氏烟,转?C1基因的本氏烟和野生本氏烟分别被浸润TRV-PDS/TRVSu或TRV-GFP。12天后,稳定表达的P6也不能抑制TRV介导的内源基因PDS/Su的系统沉默。因此,P6不能抑制内源基因PDS/Su的系统沉默。