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在我国胃癌的发生率和死亡率常年居高不下。研究表明胃癌的发生和演进受基因、表观遗传等多方面的影响,但其具体的发病机制始终未完全阐明。基因表达的变化可能出现在肿瘤的最初始阶段。表观遗传学的改变通常是影响基因表达的重要原因之一。这种改变可以引起抑癌基因和原癌基因转录表达的变化,进而影响胃癌的发生发展。在前期的工作中我们发现转录因子NFIX在胃癌组织中可能存在甲基化的改变。转录因子作为机体内一类重要的基因表达调控分子,具有激活和抑制下游靶基因转录等多方面的作用,因此该基因甲基化状态的改变有可能在胃癌的发生发展中起了重要的作用,有必要进行下一步的深入研究。本课题将在前期研究的基础上进一步鉴定NFIX基因在胃癌中的甲基化水平。并对NFIX基因在胃癌中的表达、功能和调控机制等方面展开深入的研究,以期为理解胃癌的发生发展和干预治疗提供新的治疗靶点和理论依据。【目的】1.鉴定NFIX基因在胃癌中的甲基化状况,观察NFIX在胃癌中的表达情况,分析其表达与甲基化的关系。2.研究NFIX基因在胃癌发生中的生物学作用。3.探讨NFIX基因在胃癌发生中的可能分子机制。【方法】1.利用结合亚硫酸盐的测序技术(BSP)在胃癌及癌旁正常组织中检测NFIX基因启动子区的甲基化情况。分析NFIX基因启动子区的甲基化状态在胃癌与癌旁正常组织中是否存在差异。2.利用实时荧光定量PCR和免疫组织化学的方法检测NFIX基因在胃癌及癌旁正常组织中的mRNA和蛋白表达水平。3.利用慢病毒技术构建过表达NFIX和相应对照的胃癌SGC7901细胞,筛选获得稳转细胞株,实时荧光定量PCR法检测感染有效性。4.通过高内涵、平板克隆、Transwell、侵袭实验、细胞周期实验观察过表达NFIX后对胃癌细胞生物学行为的影响。5.利用免疫沉淀(IP)的方法富集NFIX蛋白,通过Western blot和硝酸银染色验证效果。通过四级杆串联静电场轨道阱超高分辨液质联用质谱分析IP产物,对NFIX的相互作用蛋白进行初步筛选。【结果】1. BSP结果表明NFIX基因启动子区在胃癌组织中存在显著的甲基化改变。Real-time PCR和免疫组织化学结果显示,胃癌组织中NFIX的mRNA及蛋白表达水平均显著低于癌旁正常组织。2.去甲基化试剂5-Aza可以恢复胃癌细胞中NFIX的表达,表明NFIX基因启动子区的甲基化可能与该基因表达的下调有关。3.成功构建包装了NFIX过表达(LV-NFIX)和相应对照(LV-Control)慢病毒,感染SGC7901细胞。Real-time PCR证实目的病毒感染后NFIX的mRNA表达显著升高。4.过表达NFIX后可以显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时还可以抑制细胞周期由G1期向S期发展。5.成功构建包装NFIX与Flag标签融合表达的慢病毒,感染SGC7901细胞。Real-time PCR和Western blot证实目的病毒感染后NFIX-Flag的表达显著升高。6.免疫沉淀实验成功的富集了NFIX蛋白,对富集的产物进行质谱分析,初步确定RPS6KA1可能为NFIX的相互作用蛋白。【结论】综上所述,本研究证实了NFIX基因在胃癌组织中发生了显著的甲基化改变,且在胃癌组织中的表达显著下调。去甲基化药物可以部分恢复其表达,提示NFIX基因的表达受甲基化调控。构建了稳定过表达NFIX的胃癌SGC7901细胞系,进一步的功能学研究表明,过表达NFIX后可以在体外抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,表明其可能对胃癌的发生发展有抑制作用。最后通过免疫沉淀结合质谱的方法发现RPS6KA1可能是NFIX的相互作用蛋白,RPS6KA1有可能磷酸化NFIX增强其对下游基因的调控能力。