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猪链球菌是一种重要的人畜共患细菌,可引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎以及败血症,给猪的养殖业带来了巨大的经济损失。临床上主要通过抗菌药物对猪链球菌进行防治。然而,随着抗菌药物的长期使用,猪链球菌的多重耐药性逐渐增强,抗菌药物的治疗效果不断降低。因此,探究其多重耐药机制是解决细菌耐药性问题和合理用药的前提。大环内酯类药物和四环素类药物是兽医临床常用的药物。然而,猪链球菌对临床常用的大环内酯类药物、四环素类药物以及氟喹诺酮类药物的耐药性不仅越来越严重,且表现为多重耐药。氟喹诺酮类药物目前已经在我国限制使用,为什么临床分离的猪链球菌对这三类药物表现为多重耐药?故本研究针对该问题,一方面开展临床分离猪链球菌的耐药监测工作,另一方面以猪链球菌ATCC 700794为研究对象,在泰乐菌素选择压力下,通过体外诱导的方式获得了对大环内酯类、四环素类药物和氟喹诺酮类药物多重耐药猪链球菌;然后,利用生物信息学分析泰乐菌素压力下的猪链球菌蛋白质组学,发现半胱氨酸生物合成途径中的氧乙酰丝氨酸硫醇裂解酶（CysM）可能与多重耐药有关,为证明该蛋白和耐药的关系,采用基因敲除和回补技术构建cysM基因缺失株和回补株,从耐药表型、细菌生物被膜、代谢产物含量变化和基因水平四个层面上,阐明CysM调控的半胱氨酸生物合成途径与猪链球菌多重耐药性之间的关系;最后基于分子模拟和分子互作技术分析泰乐菌素是否还与CysM蛋白结合。具体研究结果如下:（1）对2017～2019年黑龙江省7个不同猪场的猪链球菌,进行了细菌的耐药监测。结果显示,目前黑龙江省临床分离的猪链球菌以4型为优势血清型,并呈多重耐药的现象。分离的猪链球菌对四环素类和大环内酯类药物耐药最为严重分别为97.5%和92.5%,大环内酯类药物的MIC50和MIC90均大于128μg/m L,扩增率最高的耐药基因分别为tet M和erm B。对氟喹诺酮类药物的耐药率为60%。结晶紫染色法测定的生物被膜形成能力结果显示,临床分离猪链球菌都具有形成生物被膜的能力。但由于临床分离的猪链球菌的耐药表型与耐药基因的符合率并不是100%,故推测生物被膜可能是猪链球菌形成多重耐药的重要因素之一。（2）基于实验室前期的蛋白组学,通过Heatmap和PPI蛋白网络重新分析了1/4 MIC（0.125μg/m L）泰乐菌素选择压力下猪链球菌的171个差异表达蛋白。结果显示CysM蛋白处于这些差异蛋白的中间位置,推测其可能与猪链球菌的耐药性有关。（3）在泰乐菌素选择压力下,利用实验室体外强诱导的方式,获得泰乐菌素耐药猪链球菌,并测定其耐药表型。结果显示,泰乐菌素耐药猪链球菌对泰乐菌素、替米考星、金霉素、四环素、氧氟沙星和恩诺沙星的MIC分别增加了256倍、128倍、64倍、4倍、32倍和4倍,而对氟苯尼考和青霉素K的MIC没有发生改变。同时,以泰乐菌素耐药猪链球菌为受试菌株,利用RT-PCR以及Western Blot技术对cysM基因和CysM蛋白的表达量进行测定,发现其表达量发生显著的上调,证明CysM蛋白可能与猪链球菌的多重耐药性有关。（4）利用同源重组的方式,结合流式细胞术获得了泰乐菌素耐药猪链球菌cysM基因缺失株,同时利用质粒回补的方式获得了回补株。通过微量稀释法测定cysM基因缺失株和cysM基因回补株的耐药表型。结果显示,在cysM基因缺失株中,泰乐菌素、四环素和恩诺沙星的MIC降低了4倍,替米考星降低了128倍,金霉素降低了8倍,氧氟沙星降低了32倍。而cysM基因回补株对上述六种药物的MIC虽然有所提高,但是没有恢复到泰乐菌素耐药猪链球菌的耐药水平。其中,泰乐菌素、氧氟沙星、恩诺沙星、金霉素和四环素的MIC升高了2倍,替米考星升高了32倍。耐药表型实验初步证明了CysM和猪链球菌的多重耐药性有关。（5）利用结晶紫染色法和扫描电子显微镜的方法,探讨cysM基因与生物被膜形成量和形成能力的关系。结果显示,在cysM基因缺失株中,生物被膜的形成量和形成能力也显著降低,证明CysM参与泰乐菌素耐药猪链球菌的生物被膜形成。（6）利用cysM基因缺失株和回补株,进行了半胱氨酸生物合成途径的中间代谢产物含量及相关基因的测定。结果表明,与泰乐菌素耐药猪链球菌相比,cysM基因缺失株中,半胱氨酸、同型半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的含量显著降低;而在回补株中,半胱氨酸和同型半胱氨酸的含量与敲除前二者的含量无显著性差异,S-腺苷甲硫氨酸的含量虽然有部分恢复,但没有恢复到敲除前的表达水平,仍具有显著性差异。cysM基因缺失株中met I、met K、mtn N和lux S基因的表达量显著性的减少;而在回补株中,met I基因的表达量与泰乐菌素耐药猪链球菌中该基因的表达量相比无显著性的差异,而met K、mtn N和lux S的基因表达量虽有部分恢复,但与敲除前基因表达量仍具有显著性差异。（7）基于分子对接和BLI技术,阐明泰乐菌素是否能与CysM蛋白结合导致猪链球菌多重耐药的产生。结果表明,泰乐菌素药物与CysM蛋白的氨基酸残基未能发生相互作用,泰乐菌素与CysM蛋白的亲和解离曲线没有变化,证明泰乐菌素和CysM蛋白没有结合。综上所述,cysM基因所调控的半胱氨酸生物合成途径可以影响猪链球菌对泰乐菌素、替米考星、恩诺沙星、氧氟沙星、金霉素和四环素的多重耐药性。